🐭 — Мордочка мыши Эмоджи: U+1F42D

грызун, полевка, крыса

U+1F42D

Emoji

Отображение этого Emoji в разных системах

Значение Эмоджи

Дружелюбная, мультяшная мордочка мыши, смотрящяя прямо вперёд. Обычно изображается с большими круглыми ушами, розовым, заостренным носом и усами.

Символ «Мордочка мыши» был утвержден как часть Юникода версии 6.0 в 2010 г. и был добавлен в Эмоджи версии 1.0 в 2015 г.

Этот текст также доступен на следующих языках:
English;

Свойства

Версия	6. 0
Блок	Разные символы и пиктограммы
Тип парной зеркальной скобки (bidi)	Нет
Композиционное исключение	Нет
Изменение регистра	1F42D
Простое изменение регистра	1F42D

Млекопитающие

Кодировка

🐭 Мышиная мордочка смайлик-эмодзи — Значение, Скопировать

Значение смайлика 🐭 Мышиная мордочка

Этот эмодзи представляет собой известного грызуна, который изображается либо вполне реалистично, либо в более мультяшной манере. В зависимости от поставщика эмодзи, он может быть как белого, так и серого цвета. Значения, в которых его используют по существу те же, что и в случае версии, в которой изображается 🐁 Лицо Мыши. То бишь он может олицетворять маленькое, беззащитное животное, а также нередко использоваться по отношению к предателям, чего-то отвратительного или, наоборот, очень милого. Здесь уж все зависит от пользователя, который будет использовать данный смайлик. +Добавить

Скопировать и вставить этот смайлик:

Скопировать →  🐭

📖 Содержание:

🐭 Мышиная мордочка — примеры использования

Популярные фразы со смайликом 🐭 Мышиная мордочка. Используйте их в переписке:

Нажмите / кликните, чтобы скопировать

• Есть у меня чувство, что под моей кроватью живе мыша 🐭
• Ты такая крыса! 🐭
• У меня только что появилась домашняя мышка! 🐭
• +Добавить

Комбинации со смайликом 🐭 Мышиная мордочка

Комбинации это всего лишь набор эмодзи, расположенные друг с другом, например: ​🧑​🐭​🚗​. Вы можете использовать комбинации, чтобы загадывать загадки или общаться без слов.

Нажмите / кликните, чтобы скопировать

• ​🧑​🐭​🚗​

   — Стюарт Литтл

• ​👨🏻​🐭​⚾️​

   — Джерри Магуайер

• ​🐭​🏃🏻​🏃🏻​🏃🏻​

   — Крысиные бега

• ​🐭​🚶🏻​🚶🏻​🚶🏻​

   — Крысиные бега

• ​🐰​🐭​🐹​

   — Грызуны

• ​🐭​🐘​

   — Боязнь мышей

• ​🧀​🐭​

   — Мышиное лакомство

• ​🐭​🐈​

   — Том и Джерри

• ​🐭​😹​🐁​

   — Мышка думает убежать

• ​🐭​🏰​🎡​👸​

   — Дисней представляет

• ​🐭​🔫​

   — Охота на мышей

• ​🐭​🏃​🏃​🏃​

   — Крысиные бега

• ​🐭​🐰​🐹​

   — Грызуны

• ​👀​👃​🐭​

   — Я чувствую апах крысы

• ​👃​🐭​

   — Запах крысы

• ​💪​⚡​🐭​

   — Могучий мышонок

• ​🙊​👉​🐭​

   — Будь тихой, как мышка

• ​🐘​🐭​

   — Слон очень боиться…

• ​🐁🤚🏻🩸​

   — Ауч!

• +Добавить

Релевантные каомодзи

Каомодзи очень популярны в Японии. )

Дизайн 🐭 Мышиная мордочка на разных устройствах

Эмодзи выглядят на различных устройствах по-разному. Каждый производитель веб-сервисов, ОС или гаджетов могут создать уникальный дизайн эмодзи в соответствии со своими фирменным стилем и видением. Здесь вы можете увидеть, как смайлик 🐭 Мышиная мордочка выглядит на различных популярных платформах:

Как нарисовать мышку? ТОП 5 вариантов для детей поэтапно

Простые варианты, как нарисовать мышку. Лучшие 5 идей для детского творчества в пошаговом исполнении.

Следуйте поэтапным рисункам, чтобы получились вот такие забавные мыши. Некоторые из них совсем простые, другие – немножко сложнее. Выбор зависит от умений и навыков ребенка, а также личных предпочтений.

Что понадобится:

• Лист бумаги;
• Простой карандаш;
• Ластик;
• Цветные карандаши, либо фломастеры.

Как нарисовать мышку? ТОП 5 идей

Рисунок мыши для детей – 1 вариант

Один из простых способов рисования мыши. Нарисуйте овал яйцеобразной формы. Узкая сторона в нижней части.

Добавьте два полукруга ушей.

Сотрите ненужные линии внутри ушек. Нарисуйте мордочку: глаза, нос, усы.

Сверху добавьте хвостик.

Контур мышки готов.

Его можно раскрасить по собственному усмотрению.

Как нарисовать мышь – 2 вариант

Еще один простейший способ для детей. На первом этапе в нижней части листка нарисуйте прямую горизонтальную линию. Соедините кончики, нарисовав сверху туловище в виде удлиненного полуовала, более узкого с одной стороны и широкого с другой.

В области узкой стороны нарисуйте овальные уши.

Ластиком сотрите линию, проходящую через одно ухо. Завершите мордочку, закрасив узкий кончик, чтобы получился нос, нарисуйте глаза и усы.

Сзади дорисуйте длинный волнистый хвост, а на туловище – полукруги, обозначающие очертание лап, а также улыбку.

Контур мышки готов.

Теперь можно приступить к раскрашиванию.

Как нарисовать мышку поэтапно – 3 способ

Простенький, идеальный для детей рисунок. Практически состоит из больших и маленьких овалов.

В центре листа нарисуйте большой овал. Он будет не только в качестве туловища, но и головы.

В верхней части изобразите два круга побольше, и два в их центре – поменьше. В нижней части большого овала нарисуйте небольшой овал, который будет животиком мышки.

Добавьте мордочку: глаза, нос, усы и улыбку с зубами.

На последнем этапе нарисуйте мышке овальные лапы по бокам и удлиненные снизу, а также хвост.

Вот такая получилась мышка в контурном варианте.

Пора вооружиться цветными карандашами и раскрасить свой шедевр в желаемые оттенки.

Рисуем мышку самостоятельно – 4 способ

Немножко усложняем работу, хотя способ также легкий, просто по сравнению с предыдущими, немножко сложнее.

Нарисуйте круглую голову.

На ней глаза, нос, улыбку, милые бровки, забавный чуб.

Сверху дорисуйте большие уши.

В нижней части головы – круглое или немного удлиненное туловище.

Завершите мышонка небольшими лапками и длинным хвостом.

Раскрасьте в желаемые расцветки.

Как нарисовать мышку – 5 вариант

Этот грызун скорее похож на крысу или забавного крысенка.

Нарисуйте в верхней части листа голову в виде горизонтально расположенного яйца.

Снизу немного отступите и нарисуйте круг-туловище.

С помощью двух дуг, которые будут шеей, соедините голову и туловище. Дорисуйте большие уши.

Сотрите внутренние ненужные линии, изобразите мордочку зверьку: глаза, усы, улыбку, обведите нос. И еще добавьте внутреннюю часть уха.

Нарисуйте овальные лапки.

Добавьте хвост, когти и рисунок мыши или крысы готов.

Теперь его можно раскрасить в подходящие желаемые цвета.

Прочитай:Мышка Серенькая шкурка, острая мордочка, зоркие глазки, острые зубки, длинный

Мышка

Серенькая шкурка, острая мордочка, зоркие глазки, острые зубки, длинный хвостик, тоненькие лапки. Быстро бегает на них маленькая зверюшка. Подберёт крошку, сгрызёт корочку, любит полакомиться и сыром, и маслом, и в хлебе прогрызёт дыру. Это мышка. «Противные мыши! Опять они расхозяйничались, — ворчат люди. – Что за вредные животные!». Но подумайте, виновата ли мышка в том, что ей хочется есть и хочется накормить получше своих голодных деток? У каждой мышки детки родятся несколько раз в год. В одном выводке бывает до десяти мышат. Сколько надо мышке добыть корма для того, чтобы прокормить своих детей, которых она любит так же, как и всякая другая мать
Где-нибудь в укромном уголке, в старой заброшенной корзинке, в пустом ящике, мышка устраивает гнёздышко, выстилая его помягче всем, что удастся ей добыть: сеном, тряпками, клочками бумаги. Здесь у неё родятся крошечные голые мышатки; мать нежно заботится о них и готова отдать за них свою жизнь.
(148 слов)

К какому типу относится данный текст? ____________________________________

Выпиши из текста, где описывается внешний вид мышки.
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Чем любит лакомиться мышка?
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Где мышка устраивает гнёздышко?
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________​

Как слепить мышь из пластилина

Как слепить мышку(мышь) из пластилина — статья из серии»Лепим из одного куска».

Хотя мыши, вообще-то, животные маленькие, но нам мелочиться ни к чему, возьмём солидный  кусок пластилина(рекомендую — величиной с детский кулак). Лепить будем как в жизни: герои мультфильмов, честно сказать, не слишком-то похожи на мышей. Договоримся, что наша мышка должна как можно больше походить на настоящую. Без некоторого упрощения нам не обойтись, но только в самых разумных и уважительных пределах.

Пластилин раскатаем, должно получиться что-то вроде конуса. Определимся с величиной головы, которая у мышей не маленькая, и составляет чуть не четверть длины тела, и наметим ушки. Хорошо, теперь прикинем, где расположить  передние лапки. А где? От головы идет шея, а затем плечи. У мышей они узкие, но есть: ведь передние лапки растут от плеч, верно?  Ну вот, с «торсом» в общих чертах определились.

Теперь  займёмся хвостом. Из конца нашего куска пластилина  вытягиваем  жгут: у основания несколько толще  и крепче и  суживающийся и заостряющийся к концу. Хвост есть, теперь займемся задними лапками, которые находятся на конце туловища, причем именно на самом конце, никак нельзя смещать их под брюшко: ногам там не место. Ну вот, у нас получилась узнаваемая мышка.

Теперь наведём  красоту:  вытянем мордочку, очень точно и прицельно наметим маленькие глазки и пальчики на лапках. Итак: мышка бежит, ну, или ползёт.

Полюбовавшись,  изменим позу: посадим  зверька на задние лапки, при этом у неё становятся заметны колени.

Не очень торчат, но под шкуркой видно, что они есть. Сидящая мышь сгибает спинку дугой.

Передние лапки сложены у груди. Голова подана слегка вперёд. Хорошая у нас получилась мышка, теперь мы можем использовать её для рисования с натуры: попросим ее повернуть голову вправо и изобразим в этой любопытной позе. Согласитесь, это очень удобно: такая мышка никуда не убежит и будет спокойно позировать, если мы  захотим её нарисовать.

Как слепить мышь из пластилина вам рассказала Марина Новикова.

Советуем почитать по теме:

Как нарисовать мышь

Как вырезать мышку из бумаги

И заодно для сравнения:

Как нарисовать крысу

Понравилась статья? Подписывайтесь на обновления нашего блога Handykids.ru l

Метки: лепка животных, лепка из целого куска, поделки для детей

Читайте также:

Google+

Марина Новикова

Мордочка мышки — квиллинг | Просто поделки

В технике квиллинг создадим мордочку мышки с большими ушками и милыми усиками. Она подойдет в качестве украшения открытки на Новый год, ведь в предстоящем году именно металлическая белая мышь станет его символом.

Материалы для изготовления мышонка в технике квиллинг:

• линейка-трафарет;
• ножницы;
• клей;
• полоски бумаги разных цветов;
• инструмент для закручивания полосок.

Поэтапное изготовление новогодней поделки квиллинг:

1. Сделаем из бумажных полосочек мордочку мышонка, который и станет символом 2020 года. Используем серый или светло-синий тон в качестве основы. Берем одну такую полоску и делим ее на два отрезка. Накручиваем первую на инструменте.

2. Переносим накрученную полосочку в ячейку №18 или №17 трафарета, чтобы она раскрутилась до определенного предела.

3. Наносим капельку клея на кончик и приклеиваем свободный ролл. Так необходимо сделать два раза, чтобы были заготовки для ушек.

4. Затем создаем из одной длинной полоски мордочку. Помещаем накрученный ролл в ячейку с номером 30.

5. Закрепляем форму клеем.

6. Пальцами прижимаем ролл и получаем новую форму для мордочки мышки. Так у нее получился длинный носик. Приклеиваем в верхней части мордочки круглые ушки при помощи клея.

7. Продолжаем создавать поделку на Новый год в технике квиллинг. Теперь уже берем полоску другого цвета. Будет достаточно всего 10 см. Ее накручиваем на инструменте для квиллинга.

8. Накрученный ролл немного раскрутится в ячейке и затем можно будет закрепить кончик капелькой клея. Это заготовка для носа. Переходим к глазам. Для них берем одну полоску черного цвета и одну – белого. Делим их пополам.

9. Склеиваем полоски разного цвета и начинаем накручивать поочередно. Получаем в центре кружка белый цвет, а по краю – черный. Заготовки для мордочки готовы.

10. Приклеиваем носик в середине фигуры, а глаза – поверх.

11. Также из небольшого отрезка черной полоски создаем усики возле носа. Немного подкручиваем концы инструментом и приклеиваем.

Получилась вот такая забавная поделка в оригинальной технике квиллинг в виде символа 2020 года. Мышонок подходим для украшения небольшой открытки на Новый год.

Ему также можно добавить туловище при помощи нескольких деталей, созданных в технике квиллинг.

Понравилась идея поделки?

Будем благодарны за любую финансовую помощь для подготовки новых мастер-классов.

Спасибо! 🙂

Загрузка…

« Предыдущая запись

Следующая запись »

15 способов нарисовать мышку или крысу

Как нарисовать простую мышку

Кадр: @Easy Kids Drawings / YouTube

Что нужно

• Бумага;
• простой карандаш или чёрный фломастер;
• цветные карандаши, фломастеры или краски.

Как нарисовать мышку

Нарисуйте фигуру в виде лежащей на боку капли, уголок которой смотрит влево.

Кадр: @Easy Kids Drawings / YouTube

В верхней части этой фигуры изобразите ушко в виде дуги. Над ней добавьте ещё одну дугу — край другого уха.

Кадр: @Easy Kids Drawings / YouTube

На уголке «капли» нарисуйте маленький кружочек — это будет нос. Слева от переднего ушка добавьте ещё один кружок и закрасьте его. Между нарисованными носом и глазом изобразите усы небольшими чёрточками.

Кадр: @Easy Kids Drawings / YouTube

Снизу, справа и слева дорисуйте по два маленьких овала — это будут лапки.

Кадр: @Easy Kids Drawings / YouTube

От середины правой части туловища выведите в сторону линию, закруглите её наверх и дорисуйте изогнутый хвостик.

Кадр: @Easy Kids Drawings / YouTube

Раскрасьте мышку: туловище — серым цветом, а нос и лапы — розовым.

Какие ещё есть варианты

Другой похожий рисунок:

Такая мышка рисуется ещё проще:

В этом видео показано, как нарисовать мышку из буквы «М»:

И ещё одно милое мультяшное животное:

Сейчас читают 🔥

Как нарисовать мышку или крысу посложнее

Кадр: @DrawinGeek / YouTube

Что нужно

• Бумага;
• простой карандаш или чёрный фломастер;
• цветные карандаши, фломастеры или краски.

Как нарисовать мышку

Нарисуйте небольшую дугу, концы которой смотрят вверх. Справа добавьте кружок и закрасьте его, оставив в середине небольшой незакрашенный участок.

Кадр: @DrawinGeek / YouTube

От носа вверх выведите закруглённую влево линию. На другом конце нижней дуги подрисуйте ещё одну такую же, но поменьше.

Кадр: @DrawinGeek / YouTube

Снизу проведите ещё одну слегка закруглённую линию — это будет нижний край головы. Над маленькой дугой нарисуйте каплеобразную фигуру — глаз — и закрасьте его уголок.

Кадр: @DrawinGeek / YouTube

В левой верхней части рисунка изобразите большое ухо в виде дуги, а за ним — ещё одно. От правого края первого уха выведите в сторону короткую черту и поднимите линию вверх. Слева добавьте ещё одну полоску покороче.

Кадр: @DrawinGeek / YouTube

От середины переднего уха выведите влево вверх линию спины и закруглите её.

Кадр: @DrawinGeek / YouTube

От конца этой линии проведите ещё одну влево, опустите вниз, закруглите вправо и доведите почти до головы. Над этой линией проведите ещё одну так, чтобы получился длинный заострённый хвост.

Кадр: @DrawinGeek / YouTube

Под спинкой нарисуйте дугу, концы которой смотрят влево — это будет бедро. Снизу дорисуйте лапку и разделите пальцы короткой чертой. От них выведите вправо небольшую линию брюшка.

Кадр: @DrawinGeek / YouTube

Справа от брюшка дорисуйте согнутую переднюю лапку и пометьте на ней пальцы.

Какие ещё есть варианты

Похожий рисунок:

Милый мышонок с кусочком сыра:

В этом необычном мастер‑классе показано, как нарисовать животное из слова rat («крыса» по‑английски). Если рисуете с ребёнком, заодно обучите его новому иностранному слову:

Чтобы изобразить эту мышку, нужно сперва сделать карандашный набросок:

А для этого рисунка понадобятся, как ни странно, монетки. Он сложнее всех предыдущих, но инструкция очень понятная:

Как нарисовать реалистичную мышь или крысу

Кадр: @How2DrawAnimals / YouTube

Что нужно

• Бумага;
• карандаш;
• ластик.

Как нарисовать крысу

Нарисуйте большой круг, а слева от него — ещё один (примерно в четыре раза меньше). Это набросок туловища и головы животного. Не нажимайте на карандаш слишком сильно.

Кадр: @How2DrawAnimals / YouTube

Маленький круг разделите двумя пересекающимися перпендикулярными линиями. Слева от круга подрисуйте фигуру в форме буквы U — мордочку крысы. В правой верхней части круга наметьте полуовальное ухо. Над головой слева добавьте ещё одно.

Кадр: @How2DrawAnimals / YouTube

Соедините очертания головы и туловища двумя изогнутыми линиями. Внизу наметьте лапы угловатыми линиями. От туловища выведите вправо линию, закруглите влево и удлините — это хвост.

Кадр: @How2DrawAnimals / YouTube

Теперь можно нажимать на карандаш посильнее. В левой верхней части головы изобразите овальный глаз со слегка вытянутыми уголками. Внутри нарисуйте маленький кружок, а всё вокруг него затемните. Добавьте несколько штрихов вокруг глаза. На конце мордочки нарисуйте кружочек. Внутри наметьте ноздрю, а по контуру пройдитесь короткими штрихами.

Кадр: @How2DrawAnimals / YouTube

Над носом и под ним очень короткими штрихами оформите края мордочки. Справа от носа подрисуйте усы. Прорисуйте контур переднего уха так, чтобы оно было немного под наклоном. Внутри него добавьте несколько линий, чтобы выделить раковину. Заднее ухо заострите и оформите так, чтобы оно было слегка загнуто. После штрихами прорисуйте контуры головы сверху и снизу.

Кадр: @How2DrawAnimals / YouTube

С помощью наброска нарисуйте переднюю лапу. Выделите пальцы и волоски на нижней части ноги. Сзади нарисуйте ещё одну лапу аналогичным образом. Над наброском задней ноги штрихами изобразите дугу. Дорисуйте лапу (более длинную, чем передние) и выделите пальцы.

Кадр: @How2DrawAnimals / YouTube

Всё теми же короткими штрихами пройдитесь по линии спины. Справа от большого круга удлините тело животного сверху и снизу, доведя штрихи до линии хвоста. Между ногами тоже прорисуйте волоски. Оформите хвост — он должен сужаться к концу.

Кадр: @How2DrawAnimals / YouTube

Аккуратно сотрите лишние карандашные наброски. Если случайно стёрли что‑то из основного рисунка, добавьте это заново.

Кадр: @How2DrawAnimals / YouTube

Затемните ушки, нижнюю часть головы, шею, заднюю ногу, нижнюю сторону туловища и хвоста.

Кадр: @How2DrawAnimals / YouTube

Добавьте тени под крысой, чтобы было видно, что она на чём‑то стоит. Штрихами пройдитесь по мордочке и всему телу животного. Располагайте штрихи по росту волосков, то есть вбок.

Какие ещё есть варианты

Вот как этот же автор рисует мышь:

Другая очень красивая и реалистичная мышка:

И ещё один профессиональный рисунок. Шерсть выглядит как настоящая:

Читайте также 🖼🖌👍

Amazon.com: Коврики для игровой мыши, коврик для мыши, намордник собаки с черной маской. Выражение лица собаки: товары для офиса

В настоящее время недоступен.
Мы не знаем, когда и появится ли этот товар в наличии.

• Убедитесь, что это подходит
  введя номер вашей модели.
• 1. мелкая текстурированная поверхность улучшает отслеживание движений мыши; создает стабильное скольжение;

• 2. нескользящая резиновая нижняя поверхность надежно удерживает рабочий стол;

• 3. конструкция с тканевым верхом и резиновой подкладкой;

• 4.Размеры: 22 x 18 см / 7,22 x 5,91 дюйма или 26 x 21 см / 8,53 x 6,89 дюйма или 30 x 25 см / 9,85 x 8,2 дюйма;

• 5. доступны три размера, быстрая доставка.

Cartoon Gorillaz положили морду на опасность Mouse, Damon Albarn

AUSTIN, Texas — Дэймон Албарн умнее, чем вы думаете.

Не то чтобы сообразительность фронтмена Blur / Gorillaz ставилась под сомнение, но концептуально идея «виртуальной группы» кажется довольно глупой. Однако за анимированными участниками 2-D, Нудл, Расселом и Мёрдоком скрывается хитрый мотив.

«Разговоры о [музыке] — это то, что [группа] любит делать», — сказал Албарн на вечеринке по прослушиванию альбома Gorillaz во время недели South by Southwest (см. «Queens Of The Stone Age Are Kings Of SXSW 2005»). «Я не думаю, что они ценят то, что мы наступаем на их территорию.Они все равно думают, что я бред, поэтому все, что я говорю, не может быть правильным, — сказал он с отрепетированной уклончивой ухмылкой.

В то время как Албарн может использовать своих анимированных персонажей в качестве хитрой махинации, чтобы избежать объяснения своих личных и музыкальных намерений, то, что можно почерпнуть из скромных Gorillaz, так это то, что их новый альбом Demon Days, выйдет 24 мая, является непрозрачным делом. как музыкально, так и тематически.

«Gorillaz делают dark pop; это то, к чему они всегда стремились», — сказал Албарн.«Весь альбом как бы рассказывает историю ночи — бодрствования ночью — но это также и аллегория. Это то, в чем мы, по сути, живем, мир в состоянии ночи».

Самым очевидным отличием от их предложения для второкурсников является отсутствие Дэна «Автоматизатора» Накамуры в качестве действующего музыкального продюсера. Вместо этого Албарн обратился к Danger Mouse, опираясь на силу The Grey Album , которая вскружила головы в прошлом году, когда беспрепятственно и незаконно соединила Beatles The White Album с Jay-Z The Black Album (см. » Ремиксеры превращают альбом Jay-Z Black в серый, белый и коричневый «).

«[Автомат] не был занят, [проект] просто нуждался в немного другом подходе», — объяснил Албарн. «Danger Mouse, на мой взгляд, один из лучших молодых продюсеров в мире. Я думаю, что последняя запись была намного проще. Это была девственная территория — анимированный хип-хоп, регги, штрих-рок, латиноамериканский рок — есть гораздо больше запутанности с этой записью «.

Для Danger Mouse, он же Брайан Бертон, давний поклонник Blur, чувства восхищения и уважения были взаимны.«Это было несложно, когда был интерес [со стороны Албарна]», — сказал Бертон. «Я слышал демо нового альбома, но самая важная часть заключалась в том, чтобы получить шанс стать частью чего-то настолько сильного — вы просто должны прыгнуть на это. У меня был очень периодический год [в 2004 году], но это определенно было большим событием, когда у меня появилась возможность [поработать с Gorillaz] ».

Как и их дебют, Gorillaz Demon Days может похвастаться набором красочных персонажей, которые не анимированы, в том числе Бути Браун из Pharcyde («Грязный Гарри»), экс-рэпера MF Doom («Ноябрь наступил») и причудливой камео. выступление Денниса Хоппера, который представил торжественный устный отрывок («Огонь, исходящий из головы обезьяны»).

Но не ждите, что Албарн расскажет, как произошло странное спаривание. «Я действительно чувствую, что группа разозлится, если они увидят, что я говорю о них, понимаете? И они намного смешнее меня», — сказал он.

Что говорит само за себя, так это пульсирующий хип-хоп рок первого сингла «Feel Good Inc.» В ролике изображен Де Ла Соул и его темное видео, похожее на Облачный город, повышающее ставку для визуально ошеломляющих анимационных клипов.

«Я думаю, что это большой шаг вперед по сравнению с последними видео, — сказал Албарн.«Влияния варьируются от классического« Скуби-Ду »до [Japanimation house] Studio Ghibli. В нем много разных текстур».

Хотя ни Албарн, ни Бертон не разглашают никаких подробностей о следующих альбомах Blur или Danger Mouse, они все же сообщили, что альтернативное сотрудничество может быть в разработке. «Мы могли бы снова работать вместе в этом году над чем-то, что я начал в Лагосе, в Нигерии, в прошлом году. Я думаю, это может быть довольно фантастично», — сказал Албарн, отметив, что этот рекорд будет отличаться от всемирно известного Mali Music проект он выпустил в 2002 году.«Это определенно афроцентрично, но на самом деле это скорее кантри-соул».

Тур по Северной Америке со «всеми персонажами» запланирован на лето, но, уже убрав в доме всего два диска за свою карьеру, будет ли Danger Mouse участвовать в третьем предложении Gorillaz?

«Это не совсем наше дело, не так ли?» — сказал Бертон со смехом, утверждая, что непостоянные анимированные персонажи могут легко снова передумать.

«Еще рано говорить, — сказал Албарн.«Успех и вещи неизбежно могут … Вы знаете, посмотрите на Game и 50 Cent. Это может легко случиться с нами».

Трек-лист Demon Days , по словам публициста Gorillaz:

• «Intro»
• «Последние живые души»
• «Дети с оружием» (с участием Нене Черри)
• «О, зеленый мир»
• «Грязный Гарри» (с изображением коричневой попки Фарсайда)
• «Feel Good Inc.» (с участием Де Ла Соула)
• «Эль Манана»
• «Все планеты, которых мы достигаем, мертвы» (с участием Айка Тернера)
• «Ноябрь наступил» (с участием MF Doom)
• «All Alone» (с участием Рутса Манувы и Мартины Топли-Берд)
• «Белый свет»
• «DARE» (с участием Шона Райдера)
• «Огонь, исходящий из головы обезьяны» (с участием Денниса Хоппера)
• «Небеса»
• «Дни демона»

Gun Mouse.50 Caliber, Black Powder и очиститель ствола для стволов дульного калибра — SUPER QUICK CLEAN GUNS

Описание

Что такое мышь-пистолет?

Это альтернатива всем прочим очистителям отверстий / змейкам. Достаточно компактный и абразивный, чтобы справиться с этой задачей, но он не повредит вашему пистолету с нашим специализированным нейлоновым чистящим материалом . Нет необходимости в заплатах или стержнях для тщательной работы. Просто используйте нашу Gun Mouse от начала до конца, и вы почувствуете силу нейлонового скруббера.В нашем продукте есть тысячи пор, которые позволяют удерживать весь этот рыхлый мусор и загрязнения, не позволяя им полностью выходить через отверстие.

Как им пользоваться?

Выньте пистолет-мышь из защитной трубки и ПОДАЙТЕ ЕЙ ДУШ … 4 — 5 раз нанесите на жирный конец (Тело) раствор для ухода SQCG (Super Quick Cleans), а затем просто накормите ХВОСТ утяжеленный конец через пролом, а когда он выйдет, дульный конец, возьмите (хвостовой) груз и веревку и медленно потяните Gun Mouse через отверстие для чистого ствола.Очистка никогда не будет проще, эффективнее или быстрее. Затем просто поместите мышь обратно в защитный чехол и закройте его, и можно идти до следующей очистки.

Как очистить мышь Gun?

Мы рекомендуем вам распылить на него SQCG, нанести раствор на Gun Mouse, а затем протереть Gun Mouse чистой тряпкой, и все загрязнения и грязь будут немедленно удалены. Ваш Gun Mouse снова готов к работе. Верните Gun Mouse обратно в защитный чехол, наденьте колпачок, и все готово.Теперь ваша Gun Mouse готова к следующей очистке огнестрельного оружия.

Как долго это продлится?

Gun Mouse прослужит очень долго. В настоящее время у нас есть один для ловушек 3 раза в неделю на двоих. Он длился более двух лет и продолжает развиваться. Их любят тысячи наших клиентов

Как предотвратить поломку Gun Mouse в моем канале ствола?

Gun Mouse прошита сверху вниз нашей специальной нитью, чтобы не допустить поломки внутри канала ствола.В качестве тягового троса мы также используем парашнур. Построен прочно и протестирован нашими инспекторами. Итак, неважно, какое огнестрельное оружие вы используете на винтовке, пистолете, дробовике, пистолете, порохе, пулемете или пушке. Вы можете тянуть Gun Mouse с полной уверенностью, что наш хвост не отделится от тела…!

ВАЖНО, ЧТО ВЫ ИСПОЛЬЗУЕТЕ ПОДХОДЯЩУЮ МЫШЬ ДЛЯ КАЛИБРОВКИ ОГНЕВОГО ОРУЖИЯ, КОТОРОЕ ВЫ ЧИСТИТЕ . ЕСЛИ ВЫ ИСПОЛЬЗУЕТЕ ОРУЖИЕ МЫШИ, БОЛЕЕ БОЛЬШЕ, чем КАЛИБРОВОЕ ОРУЖИЕ, ВЫ НАЧИНАЕТЕ ОЧИСТИТЬ, И ВЫ НАЧИНАЕТЕ ТЯНУТЬ ЕГО ЧЕРЕЗ ТОЧЬ ОСТАНОВИТЬ, ИСПОЛЬЗУЯ ОЧИСТИТЕЛЬ С КОНЦА МУЗЛА, И ВЫДВИНИТЬ ЕГО обратно.ЗАЩИТНАЯ ТРУБКА СПИСОК ПОДХОДЯЩИХ КАЛИБРОВ, В КОТОРЫХ ПРЕДНАЗНАЧЕНА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЫШИ. НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ ЖИРНУЮ МЫШЬ В КОЖЕЙ ДЫРЫ….!

Это более новый продукт. Какую гарантию вы можете мне дать?

У нас лучшая гарантия отсутствия проблем в бизнесе. Если вам нужно вернуть Gun Mouse по какой-либо причине…. просто позвоните нам. 888-381-6162.

«Мышь с длинной мордой в …» от ReYarr

Страна автора

AllAfghanistanAlbaniaAlgeriaAmerican SamoaAndorraAngolaAnguillaAntarcticaAntigua и BarbudaArgentinaArmeniaArubaAustraliaAustriaAzerbaijanBahamas, TheBahrainBangladeshBarbadosBelarusBelgiumBelizeBeninBermudaBhutanBoliviaBosnia и HerzegovinaBotswanaBouvet IslandBrazilBritish Индийский океан TerritoryBritish Virgin IslandsBruneiBulgariaBurkina FasoBurmaBurundiCambodiaCameroonCanadaCape VerdeCayman IslandsCentral африканских RepublicChadChileChinaChristmas IslandCocos (Килинг) IslandsColombiaComorosCongo, Демократическая Республика theCongo, Республика theCook IslandsCosta RicaCote d’IvoireCroatiaCubaCyprusCzech RepublicDenmarkDjiboutiDominicaDominican RepublicEast TimorEcuadorEgyptEl SalvadorEquatorial GuineaEritreaEstoniaEthiopiaFalkland острова (Мальвинские) Фарерских IslandsFijiFinlandFranceFrench ГвианаФранцузская ПолинезияФранцузские Южные и Антарктические землиГабонГамбия, ГрузияГерманияГанаГибралтарГрецияГренландияГренадаГваделупаГуамГватемалаГернсиГвинеяГвинея-БисауГайанаГаитиHeard Island a й McDonald IslandsHoly Престол (Ватикан) HondurasHong KongHungaryIcelandIndiaIndonesiaIranIraqIrelandIsle из ManIsraelItalyJamaicaJapanJerseyJordanKazakhstanKenyaKiribatiKorea, NorthKorea, SouthKuwaitKyrgyzstanLaosLatviaLebanonLesothoLiberiaLibyaLiechtensteinLithuaniaLuxembourgMacauMacedoniaMadagascarMalawiMalaysiaMaldivesMaliMaltaMarshall IslandsMartiniqueMauritaniaMauritiusMayotteMexicoMicronesia, Федеративные Штаты ofMoldovaMonacoMongoliaMontenegroMontserratMoroccoMozambiqueNamibiaNauruNepalNetherlandsNetherlands AntillesNew CaledoniaNew ZealandNicaraguaNigerNigeriaNiueNorfolk IslandNorthern Mariana IslandsNorwayOmanPakistanPalauPalestine, Государственный ofPanamaPapua Новый GuineaParaguayPeruPhilippinesPitcairn IslandsPolandPortugalPuerto RicoQatarReunionRomaniaRussiaRwandaSaint HelenaSaint Киттс и NevisSaint LuciaSaint Пьер и MiquelonSaint Винсент и GrenadinesSamoaSan MarinoSao Томе и PrincipeSaudi АравияСенегалСербияСейшельские островаСьерра-ЛеонеСингапурСловакияСловенияСоломоновы островаS omaliaSouth AfricaSouth Джорджия и Южные Сандвичевы IslandsSpainSri LankaSudanSurinameSvalbard и Ян MayenSwazilandSwedenSwitzerlandSyriaTaiwanTajikistanTanzaniaThailandTogoTokelauTongaTrinidad и TobagoTunisiaTurkeyTurkmenistanTurks и Кайкос IslandsTuvaluUgandaUkraineUnited арабского EmiratesUnited KingdomUnited StatesUnited Штаты Экваторияльная IslandsUruguayUzbekistanVanuatuVenezuelaVietnamVirgin IslandsWallis и FutunaWestern SaharaYemenZambiaZimbabwe

Белая мышь-талисман с черной мордой

Общие характеристики товара :

Костюм талисмана продается на нашем сайте RedBrokoly.com, специализирующийся на продаже талисманов, костюмов и костюмов для Европы в Интернете. Наши костюмы-талисманы идеально подойдут для нескольких коммерческих и маркетинговых акций, или для вашего публичного или частного мероприятия, или, проще говоря, для праздничного вечера с друзьями. У нас более 10 000 моделей. Мы также предлагаем индивидуальные настройки для ваших конкретных потребностей (свяжитесь с нами по адресу: [email protected]) с добавлением логотипов, изменениями цвета, регулировкой высоты или другими специальными запросами. Общие характеристики товара: Костюм талисмана продается на нашем сайте RedBrokoly.com, специализирующаяся на продаже талисманов, маскировок и костюмов для Европы в Интернете. Наши костюмы-талисманы идеально подойдут для нескольких коммерческих и маркетинговых акций, или для вашего публичного или частного мероприятия, или, проще говоря, для праздничного вечера с друзьями. У нас более 10 000 моделей. Мы также предлагаем индивидуальные настройки для ваших конкретных потребностей (свяжитесь с нами по: [электронная почта]) с добавлением логотипов, изменениями цвета, регулировкой высоты или другими специальными запросами. Все наши костюмы соответствуют действующим стандартам.Все изображения защищены авторским правом. Номера для отслеживания будут для вас. Фотографии талисманов в действии или в состоянии покоя делаются непосредственно в производственных помещениях наших маскировок.

Конституция :

Талисманы изготавливаются из 5 частей (могут быть изменены при помощи кастомизации или аксессуаров):

1. Материал головы: Материал головы — ПОЛИФОН, что делает голову легче, чем картон, и пользователь может носить ее в течение длительного времени, не чувствуя сильной усталости, не оказывая дополнительного давления на плечи.Вы можете легко очистить голову, например, водой и губкой.

2. Дыхание и зрение: при ношении пользователь может очень хорошо дышать, есть отверстие для глаз и рта, а также область шеи. Пользователь имеет хорошее зрение через голову костюма талисмана, глаза или рот.

3. Сетка для глаз: на глазке костюма есть пластиковая сетка, которая может предотвратить попадание пыли или других предметов в глаза пользователя.

4. Комплект одежды: Материал зависит от модели, возможно изготовление из синтетического материала.Фактически, он сделан из нейлона и синтетического хлопка. Пожалуйста, сначала спросите нас, если вам нужна дополнительная информация. Аксессуары и костюмы талисманов можно стирать в машине в теплой воде.

5. Туфли: такие же, как предыдущие. Вы можете выбрать размер и цвет ваших талисманов.

Мы можем настроить любой талисман по вашему запросу: наша команда находится в вашем распоряжении, будь то по электронной почте, в социальных сетях или на различных платформах онлайн-поддержки.

Этот продукт содержит :

1 талисман: легкий и водонепроницаемый с обувью и перчатками

Аксессуары (по желанию): на видео / фото: куртки, ремни и др. Аксессуары

Размеры:

Наши костюмы доступны в разных размерах (см. Подборку для каждого из них).Это размеры:

• S (160-170 см) — (от 5 футов 3 дюйма до 5 футов 7 дюймов)
• M (170-175 см) — (5 футов 6 дюймов — 5 футов 7 дюймов)
• L (175-180 см) — (5 футов 7 дюймов — 5 футов 9 дюймов)
• XL (180–185 см) — (5 футов 9 дюймов — 6 футов 1 дюйм)
• XXL (185-190 см) — (6 футов 1 дюйм — 6 футов 2 дюйма)
• XXXL (190-195 см) — (6 футов 2 дюйма — 6 футов 4 дюйма)
• XXXXL (195–225 см) — (6 футов 4 дюйма — 7 футов 4 дюйма)
• Детский размер: сообщите нам желаемый размер

Изображения костюмов талисманов в нашем интернет-магазине доступны в детских размерах.

Доставка:

Отправка с номером посылки в течение 7/10 рабочих дней после получения и подтверждения платежа в соответствии с наличием на складе. Предпродажное обслуживание в вашем распоряжении по электронной почте: [электронная почта защищена]. Бесплатная доставка при стандартной или платной экспресс-доставке (выбирайте на сайте при оформлении заказа). Мы отправляем товар через международные службы доставки (UPS, Chronopost, DHL, DPD и т. Д.), Что является самым быстрым и безопасным способом.

Мы включаем Австралию, США, Англию, Францию, Германию, Испанию, Италию, Японию, Корею.Пожалуйста, укажите свой номер телефона и адрес для доставки (при оформлении онлайн-заказа).

Harvest mouse guide: как распознать и факты | BBC Wildlife Magazine

Хищная мышь — это самый маленький вид грызунов в Великобритании, который весит менее двух пенсов. Хотя этот мышонок часто ассоциируется с сельскохозяйственными культурами, его можно встретить в самых разных средах обитания — от тростниковых зарослей до обочин дорог и грубых лугов.

Этот вид также может похвастаться уникальным умением, которым не обладает ни одно другое млекопитающее в Британии, — полуцепальным (хватательным) хвостом.Это означает, что он может завить верхнюю треть хвоста, почти как дополнительная рука, идеально подходящая для лазания по высоким стеблям.

Нам очень мало известно о количестве и распространении промысловых мышей в Великобритании, поэтому очень важно регистрировать случаи появления этих животных, чтобы мы могли улучшить стратегии сохранения и защиты их.

Узнайте больше о промысловых мышах в нашем экспертном руководстве Общества млекопитающих, в том числе о том, как их идентифицировать, диету и среду обитания.

Узнайте больше о грызунах в Великобритании:

Каково научное название мыши-жатки?

Научное название харвестерной мыши — Micromys minutus .Род Micromys принадлежит к семейству грызунов Muridae, которое является самым большим семейством грызунов, насчитывающим более 700 видов.

Micromys переводится на «микро», что означает «маленький», а mys «мышь» с минусом, означающим «крошечный». Урожайные мыши — безусловно, самые маленькие члены семьи, у них короткие тупые морды и цепкие хвосты, что означает, что они могут использовать хвост, чтобы хватать предметы.

В Британии насчитывается шесть видов мюридов, а также встречается промысловая мышь:

• Деревянная мышь ( Apodemus sylvaticus )
• Мышь с желтой шеей ( Apodemus flavicollis )
• Домовая мышь ( Mus musculus )
• Коричневая крыса ( Rattus norvegicus )
• Черная крыса ( Rattus rattus )

Как определить урожайных мышей

Насколько велики мыши для сбора урожая?

Мыши Harvest очень маленькие и весят всего 5-8 граммов.У них золотисто-рыжий мех, бледный животик и полуприцепной хвост. По сравнению с другими видами мышей, их морда кажется тупой, а глаза и уши относительно меньше. Длина их головы и туловища вместе составляет 5-7 см, а их хвост такой же длины.

Другие похожие виды, на которые стоит обратить внимание, включают:

Орешниковая соня: этот вид (а также неместная съедобная соня, которая намного больше и серого цвета) — единственные грызуны, обитающие в Великобритании, с густыми хвостами.Мех оранжевый / желтый сверху и бледный снизу с белыми отметинами на горле. У них длинные черные бакенбарды и большие черные глаза.

Орешниковая соня. © Чарли Файерс / Общество млекопитающих

Домовая мышь: В отличие от золотистой шерсти мышей-уборщиков, домашние мыши имеют серый / коричневый мех и гораздо более выступающие уши, чем маленькие тонкие уши мышей-уборщиков. Они также крупнее мышей-промысловых, с головой и длиной тела 7-9 см и с таким же размером хвоста.

Мышь домовая.© Рой Риммер / Общество млекопитающих

Лесная мышь и мышь с желтой шеей: У обеих большие выступающие глаза и уши с более темным красно-коричневым мехом, чем у мышей-уборщиков. У мышей с желтой шеей будет желтый воротник, тянущийся от одного плеча до другого через горло. У лесных мышей также может быть желтая отметина на горле, но не весь воротник. Они похожи по размеру или больше, чем домовые мыши.

Деревянная мышь. © Рой Риммер / Общество млекопитающих

Мышь с желтой шеей.© Дерек Смит / Общество млекопитающих

Рыжая полевка и полевка: у этих видов также морда меньше, чем у мышей, но они не имеют золотисто-коричневого цвета, как у промысловых мышей. Они также намного больше — 9-11 см и 20-40 г, а их хвосты короче тела.

Рыжая полевка выглядывает из дыры в стене. © Саймон Гахар / Getty

Как хищные мыши используют хвост?

Хвост мыши-хищника уникален тем, что он полуприцепной (способный хватать).Это означает, что хищные мыши могут использовать одну треть своего хвоста, чтобы хвататься за такие вещи, как стебли травы — почти как дополнительная рука! Это и их легкий вес означают, что они отличные альпинисты и могут передвигаться по высокой траве, тростнику или ежевике летом и осенью.

Урожай мыши с помощью хвоста. © Деннис Браун / Общество млекопитающих

Где водятся промысловые мыши?

Евразийская мышь-урожайная встречается в большей части Европы, а также в некоторых частях Азии, включая Китай, Японию и Индию.Их нет в Северной Ирландии или Ирландской Республике, а в Шотландии их очень мало — всего пять за последние 20 лет!

В каких средах обитания живут промысловые мыши?

Harvest мышей можно встретить в различных средах обитания, включая грубые луга, заросли тростника, прибрежные полосы, обочины дорог, живые изгороди, зерновые культуры (например, овес и пшеницу), поля и дикие птичьи посевы. Их небольшой размер и полусцепной хвост означают, что они прекрасные альпинисты и могут легко занимать стебли в этих местах обитания.

Урожай мышей. © Дерек Кроули / Общество млекопитающих

Сколько мышей урожая есть в Великобритании?

Согласно утвержденному МСОП Красному списку британских млекопитающих, который Общество млекопитающих опубликовало в 2020 году, по оценкам, их насчитывается 532 000 в Англии и 34 000 в Уэльсе, хотя в отношении этих оценок существует большая неопределенность и требуется гораздо больше исследований. должно быть сделано. В Шотландии за последние 20 лет было зарегистрировано всего пять случаев вылова мышей, и они были разбросаны между границами, Пейсли, и северным побережьем.

Что едят хищные мыши?

Урожайные мыши едят смесь семян, ягод и насекомых. Они также могут есть мох, корни и грибы. Иногда они берут зерно с кочанов злаков, оставляя характерные серповидные остатки; заметное повреждение зерновых культур встречается очень редко.

Урожайная мышь на масличном рапсе. © Рой Риммер / Общество млекопитающих

Что ест мышей урожая?

Поскольку промысловые мыши активны и днем, и ночью, на них могут охотиться несколько разных хищников, хотя обычно они составляют лишь очень небольшую часть их рациона.

Хищные виды включают куньих (таких как ласки, горностаи и хорьки), лисиц, домашних кошек, сов, ястребов, врановых, сорокопутов и фазанов. Молодняк может быть съеден дроздами или даже жабами.

Зимуют ли мышей после уборки урожая?

Harvest Мыши не впадают в спячку и могут изо всех сил пытаться выжить в холодные зимние месяцы, когда не хватает еды.

Являются ли мышей для сбора урожая территориальными?

Урожайные мыши, как правило, не являются территориальными, однако есть некоторые свидетельства того, что самки становятся территориальными во время сезона размножения, когда гнездовые гнезда имеют тенденцию к регулярному разделению.Известно, что в неволе размножающиеся самки безжалостно преследуют самцов, и при высокой плотности укусы хвоста могут быть обычным явлением.

Ведут ли хищные мыши ночной или дневной образ жизни?

Хотя в основном они активны ночью, особенно на рассвете и в сумерках, промысловые мыши могут быть активны в течение дня, особенно в летние месяцы, когда дни длиннее.

Как долго живут хищные мыши?

Harvest мыши могут жить до 18 месяцев в дикой природе, но чаще всего это будет меньше, чем в 6-12 месяцев.Например, животные, рожденные осенью, могут пережить зиму до периода размножения следующего года.

Как называют мышей-детенышей урожая?

В общем, детенышей мышей всех видов называют детенышами. Беременные самки строят специальные гнезда диаметром около 10 см (вдвое больше, чем гнездо, не предназначенное для размножения), а срок беременности составляет 17-19 дней.

Мыши-детеныши урожая. © Oxford Scientific / Getty

Самки рожают до семи детенышей, которые находятся на иждивении матери в течение первых двух недель их жизни.Они рождаются слепыми и без меха, весом не более 0,8 г каждый. Серая шерсть начинает развиваться через четыре дня, зубы — через неделю, а глаза открываются примерно через девять дней. Они выходят из гнезда примерно через 11 дней, а их золотистый мех начинает появляться через две недели.

Как определить признаки урожая мышей

Лучшим признаком урожая мышей являются их гнезда. Гнезда, не предназначенные для размножения, может быть очень трудно обнаружить, и во время сезона размножения лучше держаться подальше от гнезд, чтобы не беспокоить матери и их детенышей.

Обследование гнезд мышей-промысловых мышей обычно проводят поздней осенью и зимой, когда растительность отмерла настолько, что гнезда легче обнаружить. Иногда расколотые листья травы можно найти там, где начали строить гнезда, но еще не закончили, хотя их бывает трудно увидеть.

Гнездо мышей-мышей. © Общество млекопитающих

Где лучше всего увидеть мышей в Великобритании?

Мыши Harvest, как известно, довольно широко распространены на юге Великобритании, к югу от линии, проведенной от Уоша до реки Северн.Однако есть записи об этом виде со всей Британии и даже отдельные записи на севере, вплоть до северного побережья Шотландии!

Лучшее место для ловли мышей — высокая кочковатая трава у живых изгородей, полей и зарослей тростника. Однако, учитывая крошечный рост самого животного, это часто неуловимо, и свидетельство их присутствия в первую очередь идентифицируется по характерным плетеным гнездам из травы.

Находятся ли под угрозой промысловые мыши?

Мыши, вылавливаемые во всем мире, не находятся под угрозой исчезновения, и в настоящее время они занесены в Красный список Международного союза охраны природы (МСОП) как наименее опасные.

Однако, согласно утвержденному МСОП Красному списку британских млекопитающих, они находятся под угрозой исчезновения в Великобритании в целом. В Шотландии, где мы очень мало знаем об их численности, они находятся в критическом состоянии, в Уэльсе они уязвимы, а в Англии они классифицируются как вызывающие наименьшее беспокойство.

Что делается для сбора мышей?

Многие группы добровольцев из числа местных млекопитающих проводят в графствах опросы мышей-промысловых мышей, а зоопарк Честера также изучил их экологию в Чешире.За прошедшие годы Общество млекопитающих провело несколько исследований мышей, а осенью начнется новое общенациональное исследование.

Общество будет работать со многими местными группами с целью понять текущее распространение этого неуловимого маленького млекопитающего. Опрос будет основан на поисках гнезд и будет проводиться в Англии, Шотландии и Уэльсе. Если вы хотите принять участие в проекте, вы можете узнать больше и зарегистрировать свой интерес на веб-странице Общества млекопитающих.

По всей Великобритании существует ряд организаций, которые помогают собирать мышей, поддерживают связь с местными организациями по охране дикой природы и природоохранными организациями в вашем районе, чтобы узнать, есть ли у них какие-либо проекты по сбору мышей.

Основанное в 1954 году Общество млекопитающих — это благотворительная организация, которая содействует сохранению этих харизматических видов для будущих поколений на основе научных исследований. Как единственное общество, сосредоточенное на всех британских млекопитающих, оно работает над определением эффективных стратегий сохранения и предоставлением научных данных для определения политики и практики.

Основное изображение:

ДНК вируса папилломы мыши типа 1 (MmuPV1) часто интегрируется в доброкачественные опухоли за счет микрогомологического соединения концов

Abstract

MmuPV1 — полезная модель для изучения индуцированного папилломавирусом туморогенеза.Мы использовали RNA-seq для поиска химерных РНК, которые картируются как с MmuPV1, так и с геномами хозяина. В опухолевых тканях более высокая доля от общего числа считываний вируса приходилась на считывания химерного соединения вирус-хозяин (CJR) (1,9 — 7), чем в тканях, свободных от опухоли (0,6 ‰ — 1,3): большинство CJR были сопоставлены с вирусным E2 / E4 регион. Хотя большинство сайтов интеграции MmuPV1 были сопоставлены с межгенными областями и интронами по всему геному мыши, интеграции наблюдались более одного раза в нескольких генах: Malat1, Krt1, Krt10, Fabp5, Pard3 и Grip1; эти данные были подтверждены быстрой амплификацией концов кДНК (RACE) -Single Molecule Real-Time (SMRT) -seq или целевой ДНК-seq.Последовательности микрогомологии часто наблюдались на стыках ДНК вируса-хозяина. Инфекция и интеграция MmuPV1 влияли на экспрессию генов хозяина. Мы обнаружили, что факторы репарации двухцепочечных разрывов ДНК и микрогомологически опосредованного концевого соединения (MMEJ), такие как h3ax, Fen1, ДНК-полимераза Polθ, Cdk1 и Plk1, демонстрируют ступенчатое увеличение, а Mdc1 — снижение экспрессии в MmuPV1-инфицированные ткани и опухоли MmuPV1 относительно нормальных тканей. Повышенная экспрессия митотических киназ CDK1 и PLK1, по-видимому, коррелирует с фосфорилированием CtIP в опухолях MmuPV1, предполагая роль MMEJ-опосредованного присоединения ДНК в событиях интеграции MmuPV1, которые связаны с индуцированным MmuPV1 прогрессированием опухолей.

Информация об авторе

Стойкая инфекция ВПЧ высокого риска приводит к интеграции вирусной ДНК в геном хозяина и способствует вирусному канцерогенезу. Мы использовали модель инфекции мыши MmuPV1 для изучения туморогенеза папилломавируса и спросили, интегрируется ли ДНК MmuPV1 также в геномы инфицированных клеток мыши. Поразительно, но мы обнаружили, что интеграция MmuPV1 в инфицированный геном хозяина, как и инфекции ВПЧ высокого риска, очень распространена, и картированные сайты интеграции были распределены по всем хромосомам мыши.Последовательно мы идентифицировали микрогомологические последовательности в диапазоне 2–10 нт, всегда в областях интеграции. Мы дополнительно проверили MMEJ-опосредованную интеграцию вирусной ДНК в опухолевых тканях во время инфекции MmuPV1 и поэтапное увеличение экспрессии факторов хозяина MMEJ репарации ДНК из нормальных тканей в ткани, инфицированные MmuPV1 без опухоли, а затем в опухоли MmuPV1. Наши наблюдения предоставляют первое свидетельство интеграции MmuPV1 в инфицированных вирусом клетках и концептуальное продвижение того, как интеграция ДНК папилломавируса способствует развитию предраковых заболеваний, связанных с папилломавирусом.

Образец цитирования: Yu L, Majerciak V, Xue X-Y, Uberoi A, Lobanov A, Chen X, et al. (2021) ДНК вируса папилломы мыши типа 1 (MmuPV1) часто интегрируется в доброкачественные опухоли за счет микрогомологического соединения концов. PLoS Pathog 17 (8):
e1009812.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009812

Редактор: Ричард Б.С. Роден, Университет Джона Хопкинса, США

Поступило: 5 мая 2021 г .; Принята к печати: 19 июля 2021 г .; Опубликовано: 3 августа 2021 г.

Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, модифицировать, надстраивать или иным образом использовать в любых законных целях.Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.

Доступность данных: База данных NCBI GEO Номер доступа GSE163537 для последовательности РНК ткани мыши и номер доступа GSE163681 для последовательности ДНК целевой ткани мыши.

Финансирование: ЗМЗ финансировался Программой внутренних исследований Национальных институтов здравоохранения, Национального института рака и Центра исследований рака (ZIASC010357). PL был поддержан грантами Национальных институтов здравоохранения (CA022443, CA210807, CA228543 и DE026787).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Геномы папилломавируса реплицируются в виде внехромосомных кругов ДНК в ядре; интеграция вирусной ДНК в геном хозяина — тупиковый путь для вируса. Это отличается от ретровирусов, таких как ВИЧ, для которых интеграция ДНК-копии вирусного генома в геном хозяина является критическим этапом в цикле репликации вируса, который имеет важные последствия для сохранения ВИЧ во время успешной противовирусной терапии. [1, 2].Вирусы папилломы человека (ВПЧ) являются основной причиной рака шейки матки [3], и многочисленные исследования показали, что интегрированная ДНК ВПЧ присутствует во многих раковых тканях, связанных с ВПЧ, включая рак шейки матки [4, 5], рак головы и шеи [6, 7] и рак ротоглотки [8]. Хотя папилломавирусы сознательно не интегрируют свои геномы, в 1985 г. было показано, что интегрированная ДНК ВПЧ присутствует в линиях клеток рака шейки матки, положительных по ВПЧ [9]. Количество интегрированных копий ВПЧ коррелирует с тяжестью поражения шейки матки [10, 11] и является биомаркером прогрессирования заболевания.В интегрированных копиях ДНК ВПЧ в образцах опухолей участки разрыва вирусного генома обычно обнаруживаются в генах E1 и E2 [12, 13]. Потеря экспрессии E2 из интегрированной ДНК приводит к повышенной экспрессии вирусных онкопротеинов E6 и E7, которые необходимы для пролиферации и выживания связанных с ВПЧ раковых клеток [14–16]. Таким образом, тот факт, что ДНК ВПЧ, обнаруженные в опухолях, часто интегрированы в E1 и E2, представляет собой выбор форм интегрированной ДНК ВПЧ, которые могут помочь трансформировать клетку-хозяин, и не вызван склонностью ДНК ВПЧ к разрыву и / или интеграции. в определенных регионах.Интегрированную ДНК ВПЧ можно найти во многих местах генома хозяина. Интеграция HPV может влиять на экспрессию онкогена MYC [17, 18] или формировать вирусно-клеточный суперэнхансер, который способствует экспрессии вирусного онкогена [19], хотя последнее событие встречается редко. Механизмы, которые участвуют в интеграции ДНК ВПЧ в геном хозяина, остаются неясными. Однако инфекция ВПЧ высокого риска вызывает ответ на повреждение ДНК, который важен для репликации вирусной ДНК, но вызывает нестабильность генома хозяина [20–24].Microhomology-mediated end-joining (MMEJ) — это механизм репарации двойного разрыва (DSB), который использует короткие области гомологичных последовательностей ДНК (> = 1 bp) для склонного к ошибкам концевого соединения [25–27]. MMEJ был обнаружен в сайтах интеграции нескольких патологических вирусов, включая аденоассоциированный вирус, полиомавирус клеток Меркеля (MCV) и вирус папилломы [7, 13, 28, 29].

Вирусы папилломы являются видоспецифичными, что затрудняет изучение интеграции ВПЧ из-за отсутствия хорошей модели на животных.Мыши могут быть инфицированы вирусом папилломы мыши типа 1 или вирусом папилломы Mus musculus 1 (MmuPV1) как на слизистой, так и на коже [30–32]. MmuPV1 передается через кровь [33] и при половом контакте [34] и вызывает образование бородавок, аналогичных предраковым стадиям, вызываемым инфекциями ВПЧ у людей. Как и инфекции ВПЧ, инфекции MmuPV1 могут вызывать рак [32, 35], что делает их хорошей моделью для исследований рака у людей [36, 37]. Однако опубликованных отчетов об интеграции MmuPV1 нет. Мы спросили, интегрируется ли ДНК MmuPV1 в геномы инфицированных клеток мыши и похожа ли интеграция MmuPV1 на интеграцию ДНК HPV.

Анализы на основе ДНК и РНК имеют свои преимущества и ограничения при изучении событий интеграции ДНК HPV и MmuPV1. Теоретически анализы на основе ДНК способны обнаруживать все соединения вирус-хозяин, но производительность и чувствительность анализов ограничены [38]. Анализы на основе РНК более чувствительны, чем анализы на основе ДНК, но обнаруживают только интегрированную вирусную ДНК, если область, содержащая вирусную ДНК, транскрибируется; сайты интеграции, которые транскрипционно молчаливы, пропускаются.Если химера РНК вируса хозяина сплайсирована, точное место соединения может быть потеряно. Интегрированная вирусная ДНК была впервые проанализирована методами на основе ПЦР, такими как обнаружение интегрированных последовательностей вируса папилломы с помощью лигирования-опосредованной ПЦР (DIPS-PCR) и амплификации онкогена и транскриптов папилломавируса (APOT) [39, 40]; однако в настоящее время более широко используются секвенирование полногеномной ДНК (WGS) и секвенирование РНК (RNA-seq) с использованием платформы Illumina. RNA-seq более чувствителен, чем WGS, потому что активные гены экспрессируют несколько копий своих РНК-транскриптов.Платформа Illumina производит миллионы коротких чтений (75-150 пар оснований). Напротив, технология секвенирования одной молекулы (SMRT-seq) [41] (Pacific Biosciences (PacBio)) производит более длинные чтения (до> 50 kb), что позволяет лучше отображать, хотя пропускная способность ниже, а количество прочтений меньше. . В текущем исследовании мы объединили RNA-seq, SMRT-seq и направленную ДНК-seq для обнаружения сайтов интеграции MmuPV1 в тканях и опухолях, инфицированных MmuPV1. Мы предоставляем прямые доказательства того, что вирусная ДНК интегрирована в клетки, инфицированные MmuPV1.

Результаты

РНК-seq анализ интегрированной ДНК MmuPV1 в опухолевых тканях, индуцированных MmuPV1

Персистирующая инфекция MmuPV1 вызывает папилломы (бородавки), которые являются доброкачественными опухолями. Фиг. 1A показывает доброкачественную опухоль с внутренним стромальным слоем, промежуточным слоем из гиперпластических и койлоцитотических кератиноцитов и внешним слоем из терминально дифференцированных и ороговевших клеток. Жизненный цикл MmuPV1 аналогичен жизненному циклу всех других папилломавирусов и тесно связан с дифференцировкой кератиноцитов.Ранние вирусные гены (E2, E6 и E7) экспрессируются в недифференцированных клетках, а поздние вирусные гены (L1 и L2) экспрессируются только в высокодифференцированных клетках внешнего слоя ( Fig. 1B ) опухоли с атипичной эпидермальной гиперплазия, койлоциты и гиперкератоз (, рис. 1С, ).

Рис. 1. Папилломы, индуцированные MmuPV1, экспрессируют вирусную РНК L1.

A, Окрашивание H&E тонкого среза классической папилломы, показывающее строму внутреннего слоя, промежуточный слой гиперпластических и койлоцитотических эпителиальных клеток и внешний ороговевший ороговевший слой.Эту ткань собирали из опухоли морды самки мышей после шести месяцев инокуляции MmuPV1. B, РНК in situ гибридизация (РНК-ISH) L1 MmuPV1 из серийного среза той же папилломы, инфицированной MmuPV1, которая была обнаружена с помощью РНК-анализа с MmuPV1-специфическим зондом L1. Ткань обрабатывали ДНКазой для удаления всей вирусной ДНК перед гибридизацией. Это изображение показывает, что РНК L1 MmuPV1 (желто-коричневый цвет) предпочтительно экспрессируется в терминально дифференцированных кератиноцитах и ​​ороговевших клетках внешнего слоя. C, Увеличенный участок на панели A, показывающий атипичную гиперплазию эпидермиса, койлоциты и гиперкератоз.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009812.g001

Мы использовали анализ РНК-seq для поиска сайтов интеграции MmuPV1 как в вирусном геноме, так и в геноме мыши в девяти опухолях, вызванных инфекцией MmuPV1 (бородавки ) и трех безопухолевых MmuPV-1-инфицированных тканях [42]. Мы определили два типа считывания парных концов как химерного считывания вирус-хозяин: химерное парное считывание и считывание химерного соединения (CJR) (, рис. 2А, ).Доля химерных считываний вирус-хозяин намного выше в опухолевых тканях (1,9 — 7 от общего числа считываний вирусов), чем в инфицированных, свободных от опухолей тканях (0,6 — 1,3 ‰ от общего числа считываний вирусов) ( Рис. 2B ) . Например, хотя образец опухолевой ткани № 5 имел немного меньшее количество считываний вирусов (949 720 считываний), чем образец неопухолевой ткани № 10 (971 642 считывания), доля его химерных считываний вирус-хозяин была в 10 раз выше в опухоли. ткани (6,4), чем ткани без опухоли (0,6). Этот результат согласуется с сообщениями о том, что для ВПЧ высокого риска высокие уровни интегрированной ДНК коррелируют со степенью поражения шейки матки [10, 11].

Рис. 2. Анализ РНК-seq интеграций MmuPV1 в опухоли мыши и тканях, свободных от опухоли.

A, Диаграммы двух основных типов считываний химерных РНК, происходящих из сайта интеграции вируса. Считывания парных химерных концов, полученные в анализе РНК-seq, картировали в эталонном геноме MmuPV1 (NC_014326) и эталонном геноме мыши (mm10). Парные считывания «вирус-хозяин» определяются одним считыванием, которое полностью отображается на геном вируса, а другое считывание полностью сопоставляется с геномом хозяина.Считывание химерного соединения вирус-хозяин (CJR) — это считывание, которое содержит соединение вирус-хозяин, которое связывает последовательности в геноме вируса и геноме хозяина независимо от сплайсинга РНК. B, Число химерных РНК, считываемых из опухолевых тканей из трех различных анатомических участков, инокулированных MmuPV1 (ухо, хвост и морда) трех отдельных самок мышей. Левое ухо (без инокуляции MmuPV1) было от того же животного, которое имело нормальный внешний вид, и служило нормальным контролем для экстракции общей РНК и анализа РНК-seq. C, Распределение картированных точек разрыва интеграции (CJR) по геному MmuPV1 в девяти образцах опухолей. D, Хромосомное распределение картированных сайтов интеграции в геноме мыши на основе CJRs ChrM, митохондриальной хромосомы. E, Распределение событий интеграции MmuPV1 по геному мыши. Внешний круг представляет расположение вирусного генома (MmuPV1, красный) и 20 хромосом мыши (chr, синий). Размеры хромосом мыши пропорциональны их длине, а вирусный геном увеличен в 100000 раз.Каждая «галочка» во внутреннем круге указывает на обнаруженное событие интеграции. Черные полосы в середине отображают частоту событий интеграции MmuPV1 в каждой области, и выделены 9 генов с наибольшим количеством сайтов интеграции. Круговая диаграмма была создана с помощью пакета Circos (doi: 10.1101 / gr.092759.109). F, Круговая диаграмма, показывающая процентное распределение (% черным цветом) картированных CJR РНК в различных областях генома. Цифры в красном цвете — нормальная доля (%) каждой области в геноме мыши.CJR (сайты интеграции) были аннотированы с помощью команды annotate Peak пакета ChIPSeeker (doi: 10.1093 / bioinformatics / btv145).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009812.g002

Если ген E2 нарушается интеграцией HPV, экспрессия вирусных онкогенов E6 и E7 увеличивается, поскольку подавление транскрипции E2 теряется [43] . Когда RNA-seq использовался для картирования CJR вируса-хозяина на геном MmuPV1, большинство CJR находились в гене E2 и перекрывающемся гене E4 (, рис. 2C, ).Ранее мы показали, что, когда MmuPV1-специфические РНК были картированы на вирусном геноме, наблюдалось заметное сокращение считываний РНК, которые картировались в области E2 / E4 вирусного генома в бородавках [42]. Мы предположили, что в этой области было меньше РНК, потому что эта область часто прерывается в интегрированных копиях вирусного генома. Область E2 / E4 является частью 5 ’некодирующей области для мРНК L1 [44]. Таким образом, если интеграция вирусного генома нарушает эту область, экспрессия РНК L1 и белка L1 будет заблокирована.

Мы картировали все CJR вируса-хозяина, идентифицированные с помощью RNA-seq, с геномом мыши. После исключения 86 CJR, полученных в результате сплайсинга РНК, мы идентифицировали 14 159 CJR из девяти опухолей и 295 CJR из тканей, свободных от опухолей. Картированные сайты интеграции были распределены по всем хромосомам мыши ( Fig. 2D и 2E ), при этом CJR РНК чаще картируются на промотор, UTR и экзонные области и реже на межгенные области по сравнению с фракциями этих областей. представляют в геноме мыши (, фиг. 2F, ).Было выполнено несколько интеграций в Malat1, Flg, Krt1, Dsp, Krt10, Hrnr и Rn7sk (, рис. 2E и S1, таблица ).

Проверка данных сайта интеграции RNA-seq с помощью RACE-SMRT-seq

Чтобы подтвердить присутствие сайтов интеграции в генах-хозяевах с множественными сайтами интеграции MmuPV1, идентифицированными с помощью RNA-seq, мы выполнили 5 ‘быструю амплификацию концов кДНК (5’ RACE) с использованием общей РНК (1 мкг), выделенной из образца опухоли # 6 и 3 ‘RACE с использованием общей РНК (1 мкг), экстрагированной из объединенных образцов опухолей № 2, № 4 и № 6, с последующим секвенированием одной молекулы в реальном времени (SMRT-seq) ( Фиг.3A и S1A и S1B ) .SMRT-последовательность продуктов 5 ’и 3’ RACE, полученных из MmuPV1-специфического праймера, дала 280 и 694 кластерных химерных длинных считывания, соответственно. Мы сопоставили эти кластерные химерные длинные считывания вируса-хозяина, соответственно, с 97 и 529 аннотированными генами мыши ( S2 и S3 таблицы ). Было восстановлено меньше длинных чтений, потому что SMRT-seq произвел меньше чтений (~ 40 000), чем RNA-seq (~ 100 миллионов). Как и ожидалось, большинство химерных соединений (точек разрыва) в длинных считываниях картировано в области E2 / E4 генома MmuPV1 ( S1C и S1D фиг. ).Гены, которые имели несколько сайтов интеграции в анализе SMRT-seq, были Krt10, Krt6, Malat1 и Dsp ( S1E и S1F, фиг. ). Используя RACE-SMRT-seq, мы смогли проверить интеграции MmuPV1 в более чем 73% из 15 лучших генов (11/15), которые были идентифицированы с помощью RNA-seq ( Fig. 3B ). Длина этих генов варьировала от 0,3 до 87,6 т.п.н.

Рис. 3. Проверка сайтов интеграции MmuPV1 с помощью 5 ’и 3’ RACE в сочетании с SMRT-seq (секвенирование отдельной молекулы в реальном времени).

A, Стратегии, используемые для проверки сайтов интеграции MmuPV1 с помощью 5 ’RACE и 3’ RACE с вирус-специфическими праймерами. Ампликоны кДНК химерного вируса-хозяина, полученные из 5 ’и 3’ RACE, секвенировали с помощью SMRT-seq. P _вирус или P _хозяин указывает на использование вирусного промотора или хозяина, а pA _хозяин или pA _вирус указывает на использование сигнала полиаденилирования хозяина или вируса. B, Проверка с помощью RACE-SMRT-seq 15 наиболее предпочтительных генов-хозяев с интеграцией MmuPV1 (таблица S1), обнаруженная с помощью RNA-seq.Гены, обнаруженные двумя методами, выделены жирным шрифтом. C, Примеры полноразмерных химерных транскриптов вируса-хозяина (Krt10), обнаруженных с помощью 5 ’RACE-SMRT-seq и 3’ RACE-SMRT-seq. Вирусные праймеры (черные стрелки), используемые в реакциях RACE, показаны над линеаризованным и интегрированным вирусным геномом с цветными стрелками для промоторов хозяина (синий) и вирусного (розовый). Ниже представлены обнаруженные химерные полноразмерные транскрипты РНК вируса-хозяина, с названием и предполагаемым размером в нуклеотидах (после сплайсинга РНК), указанными справа или слева. D, РНК-seq считывает покрытие для химерного транскрипта C8112 вируса Krt10, идентифицированного с помощью 3 ’RACE-SMRT-seq и визуализированного с помощью программного обеспечения IGV. Выделены репрезентативные считывания химерного соединения (красный) и химерные парные считывания (синий) из данных RNA-seq.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009812.g003

Ген Krt10 был одним из генов, в которых в опухолевых тканях, индуцированных MmuPV1, были идентифицированы множественные интеграции с помощью RNA-seq и RACE-SMRT-seq. .Как показано на фиг. , фиг. 3C, , в вирусных ДНК, которые были интегрированы в экзон 1 Krt10, вирусный геном был линеаризован в пределах области E2 (см. Также фиг. 2C и S1C и S1D ). Химерные полноразмерные вирусные транскрипты Krt10, обнаруживаемые специфическим вирусным праймером, представлены на фиг. , рис. 3C , где показаны три химерные РНК, транскрибируемые с промотора Krt10, которые были обнаружены с помощью 5 ‘RACE-SMRT-seq, и три химерных РНК, которые были транскрибированы с вирусных промоторов, которые были обнаружены с помощью 3 ‘RACE-SMRT-seq ( S2 и S3, таблицы ).Используя полноразмерный транскрипт C8112 MmuPV1-Krt10 в качестве шаблона, мы смогли сопоставить короткие чтения, генерируемые RNA-seq, включая короткие CJR, с этим шаблоном ( Fig. 3D ). Данные ясно показывают, что интеграции MmuPV1 в области экзона 1 Krt10 могут быть картированы с использованием высокопроизводительных технологий.

Нацеленная последовательность ДНК сайтов интеграции ДНК MmuPV1

Мы выполнили целенаправленную ДНК-секвенцию для идентификации дополнительных сайтов интеграции MmuPV1. ДНК получали из MmuPV1-индуцированной опухоли (ухо и морда) и MmuPV1-инфицированной ткани без опухоли (ухо) от одной и той же мыши # 2 (, фиг. 2B, ), чтобы избежать вариации от животного к животному.Мы показали, используя ddPCR, что было 6 630 и 34 853 копий вирусного генома на клетку в опухоли уха и опухоли морды, соответственно, и 2547 копий вирусного генома на клетку в ткани уха без опухоли ( S2A Рис.). Мы использовали гель-электрофорез для отделения внехромосомной вирусной ДНК от хромосомной ДНК ( фиг. 4A, гель-панель ). Хромосомная ДНК, выделенная из геля, была фрагментирована путем разрезания, ремонта концов и dA-хвоста перед лигированием с двухцепочечным 3’-олигоадаптером, содержащим 3 ’T-выступ.Химерные фрагменты вируса-хозяина были избирательно амплифицированы с использованием адаптор-специфического праймера в комбинации с одним из трех прямых, специфичных для MmuPV1 праймеров E2, разработанных на основе наших результатов RNA-seq (см. Блок-схему на фиг. 4A, ). Этот подход позволил нам выборочно обнаружить одно из двух соединений для каждой из интегрированных ДНК MmuPV1, которые были разорваны в E2. Как и ожидалось из результатов числа копий вирусного генома ( S2A, рис. ), ДНК-секвенирование с использованием того же количества ДНК для каждого образца показало, что в опухоли уха MmuPV1 было в два раза больше CJR вируса-хозяина (7007 CJR), чем у (2753 CJR) в MmuPV1-инфицированном ухе без опухоли ( S2A, рис. ).Однако мы обнаружили только 4593 ДНК CJR в опухоли морды, несмотря на тот факт, что эта опухолевая ткань имела 34 853 копии вирусного генома на клетку, что позволяет предположить, что в опухоли морды было намного больше внехромосомных вирусных копий ДНК, чем в ткани опухоли уха. Как и ожидалось из данных анализа РНК-seq и нашей целевой стратегии ДНК-seq, большая часть амплифицированных ДНК CJR была картирована в вирусной области E2 / E4, только небольшое количество CJR было из области L2 ( Fig. 4B ) после E2.Нацеленная амплификация DNA-seq была способна захватывать сайты интеграции в L2, потому что L2 находится рядом с E2.

Рис. 4. Обнаружение сайтов интеграции MmuPV1 в опухолевых тканях MmuPV1 с помощью целевой последовательности ДНК.

A, Схематическое представление стратегий обнаружения сайтов интеграции ДНК MmuPV1 в хромосомной ДНК с помощью нацеленной последовательности ДНК. Опухоль или нормальные ткани уха животного № 2 (, фиг. 2В, ) вскрывали и использовали для выделения геномной ДНК. Эпизомальные вирусные геномы отделяли от хромосомной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле, а геномную ДНК выделяли из геля и обрабатывали ультразвуком.Срезанные фрагменты ДНК были заделаны на концах, и их 3’-концы были лигированы с адаптером. Три специфических вирусных праймера (Pr2976, Pr3277 и Pr3742) в области E2 MmuPV1 ( S10, таблица ) использовали отдельно в комбинации с адаптерным праймером для селективной ПЦР-амплификации фрагментов ДНК химерного вируса-хозяина, после чего ампликоны секвенировали. B, Распределение точек разрыва интеграции в геноме MmuPV1 по картированным CJR из целевой последовательности ДНК. C, Хромосомное распределение сайтов интеграции MmuPV1 в геноме мыши с помощью картированных CJR. D, Доля различных участков генома хозяина с сайтами интеграции MmuPV1. ***, P <0,001 в тесте хи-квадрат. E, Гены с сайтами интеграции MmuPV1, которые были идентифицированы с помощью RNA-seq (CJRs ≥ 4) и подтверждены целевой ДНК-seq (CJRs≥ 2), показаны на диаграмме Венна. F, Топ-15 генов с наибольшим количеством сайтов интеграции MmuPV1, идентифицированных с помощью направленных ДНК-seq и РНК CJR, обнаруженных с помощью RNA-seq.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009812.g004

Картирование CJR из всех трех образцов в геном мыши показало, что интегрированная ДНК MmuPV1 была широко распределена по всему геному (рис. 4C ). Мы обнаружили, что ~ 93% сайтов интеграции MmuPV1 присутствовали в межгенных и интронных областях генома мыши. Хотя только 4% сайтов интеграции находились в кодирующих экзонах, это больше, чем ожидалось (P <0,001) ( Fig. 4D ), поскольку кодирующие области составляют только ~ 2,6% генома (www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001635.20/). В межгенных регионах количество сайтов интеграции вируса в длинных вкрапленных ядерных элементах (LINE) превышает ожидаемое ( S2B, рис. ) (P <0,01), что аналогично тому, что сообщалось для интеграции HPV. [13]. Среди 1209 генов-хозяев с CJR, идентифицированных с помощью целевой ДНК-seq, мы обнаружили CJR РНК вируса-хозяина в 231 (19,1%) с помощью RNA-seq ( рис. 4E и S4 таблица ). Среди 15 лучших генов из 100 ( S5, таблица ) с множественными сайтами интеграции MmuPV1, идентифицированными с помощью целевой ДНК-seq, мы идентифицировали с помощью RNA-seq экспрессирующие химерные РНК-транскрипты в девяти (60%) ( Fig. 4F ).

Среди 1048 генов-хозяев с ≥ 2 ДНК CJR, 569 были идентифицированы из опухолей уха, 282 из опухолей морды и 197 из MmuPV1-инфицированных ушей без опухолей ( рис. 5 и таблица S6 ). Мы получили из опухоли уха, индуцированной MmuPV1, на 487 генов с интеграциями MmuPV1 больше, чем было получено из уха, инфицированного MmuPV1, без опухоли. Было 40 генов, в которых мы обнаружили интеграцию MmuPV1 как в опухолях уха, так и в опухолях морды, но не в ткани, свободной от опухоли (, рис. гены.

Рис. 5. Идентификация общих генов с интеграцией ДНК MmuPV1 в двух разных опухолевых участках одного и того же животного.

Диаграмма Венна, показывающая количество генов с множественными сайтами интеграции MmuPV1 (CJR≥ 2) в трех различных тканях животного № 2 (, фиг. 2B, ), идентифицированных с помощью целевой последовательности ДНК.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009812.g005

Интеграция MmuPV1 может влиять на экспрессию генов хозяина

Хотя RNA-seq использовалась для профилирования дифференциальной экспрессии генов-хозяев в клетках, инфицированных MmuPV1, было трудно напрямую определить влияние интеграции MmuPV1 на экспрессию генов-хозяев, поскольку популяции инфицированных клеток с интеграциями ДНК MmuPV1 очень неоднородны. и некоторая фракция инфицированных MmuPV1 клеток в тканях папилломы может не иметь какой-либо интегрированной ДНК MmuPV1.С другой стороны, большая часть интегрированной ДНК MmuPV1, которая была интегрирована в межгенные области (, фиг. 4D, ), не транскрибировалась (, фиг. 2F, ). Предположительно, это связано с отсутствием ближайшего промотора хозяина в межгенных областях. ДНК MmuPV1, интегрированная в гены, с гораздо большей вероятностью будет обнаружена в анализах химерной РНК. Мы проанализировали относительную экспрессию 40 генов с интеграциями MmuPV1, идентифицированную с помощью целевой ДНК-последовательности из двух разных опухолевых участков от одного и того же животного (, фиг. 5, ).Сначала мы сравнили данные РНК-seq для трех опухолей уха ( рис. 2B, образцы № 1, № 4 и № 7 ) и трех инфицированных MmuPV1 ушей без опухоли (образцы № 10, № 11 и № 12) из те же 3 животных ( S7, таблица ), а затем опухоль уха (образец № 4) против уха без опухоли (образец № 11) от мыши № 2 ( S8, таблица ). Мы обнаружили значительную (P <0,05) дифференциальную экспрессию (≥ 1,4 или ≤ -1,4 раза, RPKM ≥ 0,5) 8 генов в опухолях уха, из которых один (Cln8) имел вирусную ДНК, интегрированную в 6 генов. -kb концевой экзон и был активирован.Семь генов (Pdzrn3, Csf2rb, Dmd, Plekha5, Camta1, Gpc6 и Rasgrf2), которые имели вирусную ДНК, интегрированную в их интроны, были подавлены ( S8, таблица ). Мы также обнаружили CJR РНК, которые включают гены Cln8, Pdzrn3, Camta1 и Plekha5 ( S4, таблица ), но не нашли CJR для Csf2rb, Dmd, Gpc6 и Rasgrf2.

Мы обнаружили несколько сайтов интеграции MmuPV1 в генах, которые были либо высоко, либо слабо экспрессированы (фиг. 6A и S7, таблица ). Например, гены Malat1 и Krt10 имели от сотен до тысяч обнаруживаемых считываний РНК, а регулятор полярности клеток семейства Par-3 или разделение дефектного 3-го гомолога (Pard3) и белка 1, взаимодействующего с глутаматным рецептором (Grip1), имели лишь несколько (<20) детектируемые чтения РНК.Нам не удалось обнаружить изменение экспрессии этих генов-хозяев, когда образцы опухоли сравнивали с свободными от опухоли тканями, инфицированными MmuPV1.

Рис. 6. Интеграция MmuPV1, экспрессия гена-хозяина и рост клеток.

A, сайтов интеграции MmuPV1 были обнаружены в генах, которые экспрессируются как на высоком, так и на низком уровне. Каждая точка указывает ген с указанным уровнем экспрессии (RPKM) в тканях уха без опухоли и количество CJR вируса-хозяина, полученных из всех опухолевых тканей с помощью RNA-seq.RPKM — это число считываний на килобазу транскрипта на миллион отображенных считываний в последовательности РНК. B и C, Экспрессия MmuPV1 E6E7 (зеленый) коррелирует со снижением экспрессии мышиного Krt10 и Fabp5 (красный) в опухолевых тканях хвоста FoxN1 ^{nu / nu} на 21 день, как измерено с помощью РНК ISH с использованием двойного иммунофлуоресцентный РНКскопический анализ. Ядра окрашивали DAPI (синий). Шкала 100 мкм. Уровни Krt10 и Fabp5 в четырех случайно выбранных опухолевых тканях (которые экспрессируют E6E7) и четырех окружающих опухоль нормальных тканях (которые не экспрессируют E6E7) были количественно определены с помощью изображения J, усреднены и показаны в виде гистограммы справа.Статистические сравнения были рассчитаны с помощью непарного двустороннего критерия Стьюдента t . ** р <0,01. D, Нокдаун экспрессии Pard3 или Grip1 ген-специфической siRNA способствует пролиферации клеток. Нокдаун siRNA экспрессии Pard3 и Grip1 в первичных кератиноцитах мыши подтверждали вестерн-блоттингом, при этом Gapdh служил в качестве контроля загрузки образца. Первичные кератиноциты мыши трансфицировали 40 нМ миРНК дважды с интервалом 24 часа и анализировали с помощью анализа пролиферации клеток WST-8.NS, неспецифическая миРНК; ГОИ, представляющий интерес ген. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка трех повторов. Статистические сравнения были рассчитаны с помощью непарного двустороннего критерия Стьюдента t . * р <0,05.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009812.g006

Мы также проанализировали экспрессию Krt10 и Fabp5, двух высокоэкспрессированных генов, которые имели несколько сайтов интеграции MmuPV1 в опухолевых тканях, и выполнили ISH РНК с использованием технологии RNAscope. Мы обнаружили снижение уровней РНК Krt10 и Fabp5 в опухолях хвоста, индуцированных MmuPV1, через 21 день после вирусной инфекции.Это снижение было связано с высоким уровнем вирусной РНК E6 / E7 по сравнению с областями, свободными от опухоли, которые имели мало или не имели вирусной РНК E6 / E7 ( Рис. 6B и 6C ). Количественный анализ, проведенный гибридизацией с РНК Krt10 и Fabp5, показал, что наблюдалось снижение на 41,4% Krt10 и на 38% уменьшение Fabp5 в областях опухолей, экспрессирующих E6 / E7, по сравнению с соседними нормальными тканями, которые не экспрессировали E6 / E7 (, рис. 6B и 6C, гистограммы ). Эти данные предполагают, что снижение уровней РНК Krt10 и Fabp5 является следствием потери клеточной дифференцировки, а не прямым следствием интеграции вирусной ДНК.

Гены Pard3 и Grip1 экспрессируются на низких уровнях; однако мы смогли восстановить сайты интеграции MmuPV1 в этих генах как с помощью RNA-seq, так и с помощью целевой ДНК-seq (, рис. 6A, S4 и S7, таблицы ). Pard3 контролирует клеточную полярность и играет важную роль в онкогенезе эпителиальных клеток [45]. Grip1 — это адаптерный белок, состоящий из семи PDZ-доменов, который участвует в разнообразных межбелковых взаимодействиях [46]. Использование миРНК для подавления экспрессии Pard3 и Grip1 в первичных кератиноцитах мыши значительно способствовало пролиферации клеток (, фиг. 6D, ).Сбивание с ног Pard3 имело больший эффект, чем сбивание с Grip1. Проточная цитометрия показывает, что нокдаун Pard3 и Grip1 был связан с увеличением перехода клеточного цикла ( S3, фиг. ). Мы обнаружили, что нокдаун Pard3 снижает количество клеток в G0 / G1 и увеличивает количество клеток, попадающих в G2 / M, тогда как нокдаун Grip1 ускоряет переход от G0 / G1 к S ( S3, рис. ).

Идентификация микрогомологических последовательностей в сайтах интеграции MmuPV1

Микрогомологические последовательности (MHS) присутствуют в аберрантных сайтах интеграции ВИЧ-1, которые не опосредуются интегразой (IN) [47–50], и в сайтах интеграции аденоассоциированного вируса, папилломавируса и MCV [13, 28, 29] .Мы проанализировали последовательности соединения вирус-хозяин как с помощью RNA-seq, так и с помощью целевой ДНК-seq, сравнивая последовательности генома MmuPV1 и генома мыши. Как обсуждалось ранее, CJR, идентифицированные с помощью RNA-seq, в которых соединения опосредованы сплайсингом РНК вирус-хозяин, были исключены из анализа. Мы обнаружили MHS ​​в диапазоне 2–10 нт в области стыка большинства CJR. MHS, определяющий признак концевого соединения, опосредованного микрогомологией (MMEJ) [25, 26], был значительно обогащен в обоих наборах данных ( Рис. 7A и 7B ).Как показано на фиг. 7C , MmuPV1 MHS из 4 нуклеотидов были обнаружены для Krt10, 5 нуклеотидов для Malat1 и Grip1 в соединениях вирус-хозяин, идентифицированных с помощью RNA-seq.

Рис. 7. Идентификация микрогомологических последовательностей в интеграционных соединениях MmuPV1.

A и B, Последовательности микрогомологии (MHS) обогащены в областях соединения CJR, идентифицированных с помощью RNA-seq ( A ) и целевой ДНК-seq ( B ) по сравнению с ожидаемой MHS на гипотетической область сочленения CJR.***, P <0,001 в тесте хи-квадрат. C , MHS, идентифицированный в соединениях интеграции MmuPV1-хозяин в Krt10, Malat1 и Grip1 с помощью RNA-seq. Желтым цветом показана MHS на стыке интеграции между эталонными геномами MmuPV1 (NC_014326) и мыши (mm10). Синий и красный цвета обозначают восходящие и нисходящие последовательности хозяина и вируса на стыке сайта интеграции. D, Проверка MHS в сайте интеграции MmuPV1-Krt10 из тканей опухоли морды животного № 2 ( фиг. 2B для образца № 6 ) с помощью ОТ-ПЦР и секвенирования.Пара праймеров oLLY374 (расположенная на Krt10) и oLLY44 (расположенная на участке E2 MmuPV1) была использована для первого раунда ПЦР, а пара праймеров oLLY375 (расположенная на Krt10) и oXYX9 (расположенная на участке E2 MmuPV1) была использована для вложенных ПЦР (верхняя диаграмма). Пару праймеров oMA1 из гена Gapdh и oLLY44 из MmuPV1 использовали в качестве отрицательного контроля. См. Подробности в S10 Table для всех последовательностей и местоположений праймеров. MHS (GCCT) в ампликонах (панель геля, дорожка 3) был подтвержден секвенированием по Сэнгеру (справа) и выделен желтым прямоугольником.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009812.g007

Мы использовали вложенную ОТ-ПЦР для подтверждения MHS в химерных соединениях транскриптов MmuPV1-Krt10 в опухолевых тканях на основе положения CJR, идентифицированных РНК. -seq. Как показано на фиг. , фиг. 7D, , ОТ-ПЦР, с использованием пар праймеров для Krt10 в комбинации с MmuPV1, мы обнаружили химерную РНК MmuPV1-Krt10 ожидаемого размера из общей РНК, экстрагированной из опухолевой ткани MmuPV1 (гелевая панель на фиг. 7D, дорожка 3 ), но не РНК Gapdh отрицательного контроля ( гелевая панель фиг. 7D, дорожка 2 ).Секвенирование очищенных ампликонов RT-PCR подтвердило MHS 4 нт в РНК-соединении химерных транскриптов Krt10-MmuPV1 ( фиг. 7D, правая хроматограмма ).

Измененная экспрессия факторов репарации ДНК h3ax, Fen1, Cdk1, Plk1, Polθ, Mdc1 и фосфорилирование h3AX и CtIP в опухолях, индуцированных инфекцией MmuPV1

Папилломавирусная инфекция активирует ответ на повреждение ДНК хозяина [51, 52]. Многие факторы репарации ДНК вносят вклад в MMEJ в клетках млекопитающих и дрожжей [25, 53–55].Чтобы определить, может ли экспрессия факторов хозяина, участвующих в MRN (MRE11-RAD50-NBS1) -CtIP-зависимом MMEJ, изменяться во время инфекции MmuPV1 и индукции папилломы, мы проанализировали два отдельных набора данных RNA-seq [42, 56], чтобы определить, наблюдалось увеличение экспрессии генов репарации ДНК, особенно в 21 гене, вовлеченном в MMEJ [26], в опухолевых тканях, индуцированных MmuPV1, по сравнению с MmuPV1-инфицированными свободными от опухоли или нормальными контрольными тканями ( S9, таблица ). Мы обнаружили, что в опухолях, индуцированных MmuPV1, были повышенные уровни РНК для ответчика на двухцепочечный разрыв ДНК (DSB) h3ax (1.В 7 раз) [57, 58], эндонуклеаза лоскута 1 (Fen1, в 1,6 раза) [59, 60], две митотические киназы Cdk1 (в 1,5 раза) и Plk1 (в 1,3 раза) и ДНК-полимераза тета (Polθ, В 1,5 раза) [61–64], но наблюдалось снижение экспрессии ингибитора CtIP, медиатора контрольной точки повреждения ДНК 1 (Mdc1, -1,4 раза) [26] ( Fig. 8A ). Увеличение уровней экспрессии этих генов было больше в опухолях, индуцированных MmuPV1, чем в тканях, свободных от опухолей, инфицированных MmuPV1 ( S9, таблица ). Мы подтвердили повышенную экспрессию РНК MMEJ-связанных h3ax, Fen1, Cdk1, Plk1 и Polθ и снижение экспрессии РНК Mdc1 в опухолевых тканях MmuPV1 с помощью RT-qPCR в реальном времени ( рис. 8B ).Мы также подтвердили повышенное фосфорилирование белка h3AX в S139 (также называемое γh3AX) и повышенную экспрессию общего белка FEN1 в двух опухолевых тканях MmuPV1 ( образцов 1 и 4 на рис. 2B ) по сравнению с двумя тканями, свободными от опухоли ( , образцы 10 и 12 на фиг. 2B, ) (, фиг. 8C, ).

Рис. 8. Экспрессия факторов репарации ДНК хозяина в опухоли, индуцированной MmuPV1, и инфицированных MmuPV1 тканях, свободных от опухоли.

A, Распределение картированных считываний РНК-seq для h3ax, Fen1, Cdk1, Plk1, Polθ и Mdc1 в опухолевой (образец № 4) и безопухолевой (образец № 11) тканях уха ( см. Рис. 2B ) в геном мыши были визуализированы с помощью IGV. B, Количественная экспрессия РНК для h3ax, Fen1, Cdk1, Plk1, Polθ и Mdc1 из тканей уха с помощью RT-qPCR. Суммарная РНК, экстрагированная из опухоли MmuPV1 (образец № 4) и безопухолевой (образец № 11) ушной ткани животного № 2 (, см. Фиг. 2B, ). Уровни экспрессии РНК указанных генов определяли с помощью RT-qPCR с использованием мышиных геноспецифичных зондов TaqMan. C, Phosphor-h3AX (S139) (γh3AX), FEN1, CtIP и фосфор-CtIP (S327) в образцах опухолей № 1 и № 4 и образцах без опухолей № 10 и № 12) ( см. Рис. 2B ) определяли Вестерн-блоттингом с использованием указанных антител.Тубулин служил контролем загрузки образца.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009812.g008

CtIP и FEN1 являются важными факторами в пути репарации DSB, опосредованном MMEJ, которые опосредуют репарацию концов ДНК способами, которые позволяют микрогомологически опосредованное соединение концов [65 –69]. Cdk1 и Plk1 — две протеинкиназы, ответственные за фосфорилирование и активацию CtIP [70, 71]. Таким образом, повышенная экспрессия Cdk1 и Plk1 в опухолевых тканях, индуцированных MmuPV1, может способствовать экспрессии и фосфорилированию CtIP.Иммуноблоттинг был проведен на CtIP на двух тканях опухоли уха MmuPV1 ( образцов 1 и 4 на фиг. 2B ) и двух MmuPV1-инфицированных безопухолевых тканях уха ( образцов 10 и 12 на фиг. 2B ). Было увеличение количества белка CtIP в двух опухолевых тканях MmuPV1 по сравнению с двумя тканями, свободными от опухоли (, фиг. 8C, ). CtIP, который фосфорилировался по S327, был обнаружен только в двух опухолях уха MmuPV1, но не в двух тканях уха, свободных от опухоли ( Fig. 8C ). Эти данные предполагают, что повышенная экспрессия Cdk1 и Plk1 в опухолевых ушах может быть ответственной за повышенное фосфорилирование CtIP [70].

Обсуждение

Мышь, инфицированная MmuPV1, может быть использована в качестве модели патогенеза вируса папилломы человека [56, 72, 73]. Инфекции кожи, слизистых оболочек и крови мышей MmuPV1 приводят к развитию доброкачественных папиллом (бородавок) и к предраковым поражениям и карциномам высокой степени [32, 73, 74]. Мы обнаружили, что интеграция MmuPV1 обычна в опухолях, индуцированных MmuPV1, в ухе, хвосте и морде инфицированной мыши. Подобно интегрированной ДНК HPV [12, 13], интегрированный MmuPV1 часто линеаризовался в области гена E2 ( Fig 2C ).Вероятно, это результат постинтеграционной селекции на рост клеток, а не предпочтительной интеграции в этой области вирусного генома. Линеаризация генома MmuPV1 в E2 предотвращает экспрессию нормальных ранних транскриптов MmuPV1 за счет замещения сигнала поли-A, который используется для вирусных ранних РНК.

Мы обнаружили, что ДНК MmuPV1 может быть вставлена ​​во многие места генома хозяина, хотя мы не определили, какая часть клеток в опухоли имеет интегрированную вирусную ДНК.Большая часть генома хозяина либо межгенная, либо интронная, и, как и ожидалось, мы обнаружили, что ДНК MmuPV1 часто интегрируется в межгенные и интронные области. Есть также интеграции в повторяющиеся последовательности. Лишь небольшая часть (4%) интегрированной ДНК MmuPV1 была обнаружена в кодирующих экзонах; однако кодирующие экзоны составляют лишь ~ 2,6% генома мыши. Хотя ДНК MmuPV1 часто интегрируется в межгенные области, экспрессируется только небольшая фракция ДНК MmuPV1, которая интегрирована в межгенные области ( фиг. 2F и 4D). Вероятно, это связано с тем, что в межгенных областях нет промоторов-хозяев. Для интегрированных ДНК MmuPV1, которые были линеаризованы в области E2, экспрессия вирусных последовательностей потребовала бы, чтобы сигнал поли-A обеспечивался соседними последовательностями хозяина [75].

Используя RNA-seq и RACE-SMRT-seq, мы идентифицировали несколько сайтов интеграции MmuPV1 в группе генов, длина которых варьировалась от 0,3 kb до 87,6 kb ( Fig. 3B ). Эти гены включают как высокоэкспрессируемые, так и слабоэкспрессируемые гены.Было трудно определить относительные уровни экспрессии этих генов с помощью анализа РНК-seq в опухоли MmuPV1 и неопухолевых тканях, потому что ткани были перемешаны. Однако с помощью РНК ISH (технология RNAscope) мы показали, что была снижена экспрессия Krt10 и Fabp5 в опухолевых тканях MmuPV1. Мы думаем, что снижение экспрессии этих двух генов было следствием ингибирования дифференцировки вируса, отличительной чертой повреждений, вызванных папилломавирусом, и не было напрямую связано с местами интеграции ДНК MmuPV1.

MMEJ представляет собой Ku-независимый, Polθ-зависимый, путь репарации ДНК DSB [26, 62–64], который может быть вовлечен в аберрантную IN-независимую интеграцию ВИЧ-1 [47–49] и интеграцию аденоассоциированного вируса, папилломавируса и MCV. [7, 13, 28, 29]. Мы показали, что большинство соединений вирус-хозяин несут 2–10 нт MHS между MmuPV1 и ДНК хозяина. С помощью ОТ-ПЦР мы также идентифицировали эти MHS ​​в транскриптах РНК MmuPV1-Krt10 в опухолевой ткани MmuPV1. Наши данные показывают, что в этом отношении интеграции MmuPV1 и HPV схожи [7, 13].

Пять этапов (резекция конца, отжиг MHS, удаление лоскута, синтез заполнения и лигирование) и более десяти факторов хозяина задействованы в MMEJ. Первым шагом для MMEJ является ограниченная резекция концов DSB нуклеазами хозяина, которая обнажает микрогомологичные последовательности [25, 54]. Нуклеазы-хозяева CtIP и FEN1 являются двумя факторами, которые генерируют 3 ’выступ, закладывая основу для Polθ-опосредованного MMEJ [62, 63, 68, 71, 76–78]. Чтобы быть активным, CtIP должен фосфорилироваться по S327, S723 и T859 с помощью трех сериновых / треониновых протеинкиназ хозяина: CDK1, Aurora A и PLK1 [67, 68, 70].Мы обнаружили, что опухоли MmuPV1 демонстрируют повышенные уровни как РНК Fen1, так и белка и имеют более высокие уровни как РНК Cdk1, так и Plk1 по сравнению с инфицированными MmuPV1 тканями, которые не стали опухолями. Повышенная экспрессия CtIP и фосфорилирование S327 были обнаружены только в опухолевых тканях MmuPV1, но не в тканях, свободных от опухолей, инфицированных MmuPV1. Недавнее сообщение показало, что фосфорилирование CtIP по S327 с помощью CDK1 / Aurora A запускает связывание CtIP с PLK1, что облегчает фосфорилирование с помощью PLK1 CtIP по S723, тем самым инициируя резекцию конца [70].

Начальная интеграция ДНК MmuPV1 должна происходить в инфицированных, но все еще нормальных тканях. Таким образом, повышенная экспрессия факторов хозяина MMEJ не играла бы роли в инициирующих событиях. Однако количество интегрированной вирусной ДНК выше в опухолевых тканях, и наблюдается постепенное увеличение экспрессии этих генов-хозяев от нормальных тканей до тканей, инфицированных MmuPV1, не содержащих опухоли, а затем до опухолей MmuPV1 ( S9 Таблица ). Это увеличение может играть роль в повышенных уровнях интеграции вирусной ДНК в опухолях (, фиг. 5, ).

Способствует ли инфекция MmuPV1 разрыву / повреждению ДНК вирусного генома и генома хозяина, что приводит к интеграции вирусной ДНК, еще предстоит исследовать. Мы обнаружили, что повышенная экспрессия γh3AX, чувствительного молекулярного маркера повреждения ДНК [57, 58], была обнаружена только в MmuPV1-индуцированной опухоли, но не в MmuPV1-инфицированных тканях, свободных от опухоли. Если задействованы вирусные факторы, их роли не определены. Интеграции вирусной ДНК могут способствовать очень высокие уровни вирусной ДНК, которые присутствуют в инфицированных клетках с повышенной экспрессией факторов репарации ДНК.Известно, что папилломавирус Е7 в культурах клеток активирует экспрессию генов повреждения ДНК, опосредованных ATM и ATR, экспрессия которых критична для репликации вирусной ДНК [51, 79]. E7 в нормальных кератиноцитах крайней плоти человека вызывает митотические дефекты и нестабильность генома хозяина с повышенной экспрессией γh3AX [20–22], предположительно за счет стимулирования репликации ДНК хозяина и увеличения как гомологичной рекомбинации, так и MMEJ репортерной ДНК GFP с DSB в клетках U2OS [80], линия клеток остеосаркомы, не поддерживающая папилломавирусную инфекцию.

Здесь мы предлагаем модель того, как инфекция MmuPV1 может привести к вирусной интеграции и онкогенезу ( Рис. 9 ). В этой модели инфекция MmuPV1 кератиноцитов хозяина вызывает ответ на повреждение ДНК, который важен для репликации вирусной ДНК, а также запускает нестабильность как вирусного генома, так и генома хозяина, вероятно, за счет действия E7 и / или других вирусных белков и белков хозяина. Если вирусный геном линеаризован, он может быть случайно вставлен в любую порезанную или поврежденную область генома хозяина, чаще всего с помощью пути репарации ДНК, опосредованного MMEJ.Хотя интеграция вирусной ДНК является редким событием во время вирусной инфекции и тупиком для продуктивной инфекции MmuPV1, интегрированные копии ДНК MmuPV1 накапливаются в геноме хозяина как функция времени после инфицирования MmuPV1. Увеличение интегрированной вирусной ДНК сопровождается повышенной экспрессией h3ax, Fen1, Cdk1, Plk1, а также фосфорилированием Polθ и CtIP. Это увеличение количества интегрированной ДНК MmuPV1 способствует образованию опухоли. Высокие уровни интегрированной вирусной ДНК через линеаризованную область E2 вызывают увеличение экспрессии вирусных онкогенов [14–16], что приводит к клональной экспансии клеток, прогрессированию опухоли и, в конечном итоге, к раку.

Рис. 9. Предлагаемая модель роли интегрированной ДНК MmuPV1 в онкогенезе.

После вирусной инфекции, индукция MmuPV1 ответа на повреждение ДНК хозяина и активация аппарата репарации клеточной ДНК усиливают разрушение и рекомбинацию как вирусного генома, так и генома хозяина. Линеаризованные вирусные геномы (вДНК) могут быть слиты с любой разорванной или поврежденной областью генома-хозяина (гДНК), скорее всего, с помощью пути репарации ДНК, опосредованного микрогомологией ( A ). Интеграция MmuPV1 в геномную ДНК хозяина, по-видимому, в основном случайна; однако то, что мы обнаружили в наших экспериментах, было изменено постинтеграционным отбором.Интегрированная ДНК MmuPV1 со временем накапливается после инфицирования MmuPV1, способствуя образованию опухоли. Клональная экспансия клеток, которые экспрессируют вирусные E6 и E7 из интегрированной ДНК MmuPV1 через линеаризованную область E2 [14–16], приводит к прогрессированию опухоли и, в конечном итоге, к раку ( B ).

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009812.g009

Материалы и методы

Этические положения

Все процедуры, связанные с животными и их содержанием, проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Медицинской школы Университета Висконсина (IACUC, номер протокола: M02478).Мышей содержали в отделении по уходу за лабораторными животными McArdle в строгом соответствии с руководящими принципами, утвержденными Ассоциацией по оценке ухода за лабораторными животными (AALAC) при Медицинской школе Университета Висконсина.

Модель мыши MmuPV1 и коллекция образцов

Описание модели мыши MmuPV1 было опубликовано ранее [74]. Вкратце, три иммунодефицитных бестимусных мыши BALB / c FoxN1 ^{nu / nu} (возраст 6-8 недель) были инфицированы фиксированным количеством MmuPV1 (10 ⁸ эквивалентов вирусного генома (VGE) на участок инфекции) после скарификации кожи хвост, ухо и морда.Ткани бородавок из трех анатомических участков (уха, хвоста и морды) собирали у каждого животного через шесть месяцев или через определенное время после инфицирования. Образцы мгновенно замораживали в жидком азоте для выделения РНК / ДНК / белка. Ткани папилломы также вырезали, фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине и заливали парафином. Серийные срезы (толщиной 5 мкм) готовили для окрашивания H&E и последующих анализов.

Секвенирование общей РНК и биоинформатика

РНК, экстрагированных из тканей мыши с использованием реагента TriPure (Roche, # 11667165001), обрабатывали набором TURBO DNA-free Kit (Thermo Fisher Scientific, # AM1907) для удаления любых остатков ДНК.Библиотеки кДНК были сконструированы в соответствии с протоколом Illumina Stranded Total RNA (Illumina, # RS-122-2201) и секвенированы на Illumina HiSeq 2500 с модальностью 2 × 125 нт и глубиной 100 миллионов считываний на образец. Чтения были обрезаны с помощью программы cutadapt v 1.16 (DOI: 10.14806 / ej.17.1.200) для фильтрации низкокачественных чтений и удаления последовательностей адаптеров. Контроль качества выполнялся с помощью FastQC ( http : // www . bioinformatics . babraham . ac . uk ), и чтения были проверены на загрязнение с помощью FastqScreen v 0.9.3 (https://doi.org/10.12688/f1000research.15931.2). Последовательности кДНК были сопоставлены с последовательностями в MmuPV1 (NC_014326) и геноме мыши (GRCm38-mm10), и считанные данные были сопоставлены с использованием пакета выравнивателя STAR v 2.5.2b [81]. Считывания с парных концов — это два считывания, происходящие из одного и того же фрагмента кДНК, при этом одно считывание происходит с адаптера, лигированного с концом фрагмента, который соответствует 5′-концу РНК, а другое — с адаптера, лигированного с концом фрагмента, который соответствует 3′-концу РНК.Считывания с парным концом, которые идеально выровнены только с MmuPV1 или геномом мыши, были удалены, а оставшиеся «химерные считывания» были проанализированы. Мы определили два типа химерного чтения: химерное парное чтение и чтение химерного соединения. Химерные парные чтения — это чтения с парных концов, в которых одно чтение полностью выровнено с геномом MmuPV1 (как определено выравнивателем), а другое чтение полностью выровнено с геномом мыши. Это говорит о том, что между двумя чтениями существует интеграционное соединение.Считывание химерного соединения (CJR) — это считывание, которое частично совмещено с геномами MmuPV1 и мыши по меньшей мере на 20 нт. Хотя небольшая часть соединений РНК хозяин / вирус происходит из событий сплайсинга, мы исключили те, в которых соединения были созданы путем сплайсинга, из данных, которые мы представляем (см. Результаты). Расчеты микрогомологии были основаны на количестве перекрывающихся нуклеотидов, идентифицированных STAR между последовательностями вируса и хозяина на стыках химерных считываний (считывание на стыке сайта интеграции).Исходные данные и проанализированные данные RNA-seq, подтверждающие результаты этого исследования, были депонированы в базе данных NCBI GEO (номер доступа: GSE163537).

Быстрая амплификация концов кДНК (RACE) и секвенирование отдельной молекулы в реальном времени (SMRT-seq)

Набор для амплификации кДНК Smart RACE (Clontech, # 634858) использовали, следуя инструкциям производителя, для выполнения 5 ‘/ 3 ’RACE-анализов с 1 мкг / реакция общей РНК в качестве матрицы. Праймеры, используемые в анализах, перечислены в S10 Table .Продукты 5 ’RACE секвенировали с помощью SMRT-seq с использованием технологии PacBio Iso-seq (Pacific Biosciences). Продукты 3 ’RACE были выбраны по размеру с использованием BluePippin (Sage science, MA) для удаления продуктов с размером меньше 1500 п.н. Детали SMRT-seq были описаны ранее [42].

Пакет анализа

PacBio SMRT-seq (smrtpipe.py v2.0, с настройками по умолчанию) использовался для обработки данных последовательности в циклические согласованные последовательности (CCS), которые использовались для дальнейшего анализа. Считывания CCS были выровнены с геномом MmuPV1 (NC_014326) и геномом мыши (GRCm38-mm10) с помощью STAR-long (STARlong — runMode alignReads \ —readNameSeparator space \ —outFilterMultimapScoreRange 1 \ —outFilterMismatchNmaxCore 2000 \ —outFilterMismatchNmaxcore 200 \ —outFilterMismatchNmaxchor 200 \ — \ —ScoreGapGCAG -4 \ —scoreGapATAC -8 \ —scoreDelBase -1 \ —scoreDelOpen -1 \ —scoreInsOpen -1 \ —scoreInsBase -1 \ —seedSearchLmax 30 \ —seedSearchStartLmax 50 \ —seedPerReadNmax 100000 \ —seedPerReadNmax 100000 \ —seedPerReadNmax 100000 \ — \ —AlignTranscriptsPerWindowNmax 10000 \ —alignEndsType Local) после удаления последовательностей адаптеров, поли (A) хвостов и искусственных химер.Затем выполняли этап кластеризации с использованием иерархического n * log (n) выравнивания и итеративного слияния кластеров с аналогичными изоформами кластера вместе. Химерные транскрипты определяются как считывания CCS с выравниванием по меньшей мере 50 п.н. по геному мыши и по меньшей мере 100 п.н. по геному MmuPV1.

Экстракция геномной ДНК мыши и цифровая ПЦР в каплях (ddPCR)

Ткани мыши переваривали протеиназой К при 50 ° C в течение ночи, и геномную ДНК осаждали этанолом в присутствии хлорида натрия.Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific).

Число копий ДНК MmuPV1 на клетку в инфицированных тканях мыши определяли с помощью ddPCR. Три образца геномной ДНК получали из тканей мышей, инфицированных MmuPV1, и один контрольный образец геномной ДНК получали из нормальной ткани мыши, свободной от инфекции MmuPV1. Все образцы ДНК разводили каждый до 10 нг / мкл TE-буфером с низким содержанием EDTA (10 мМ Tris-HCl, 0,1 мМ EDTA, pH = 8.0). Ген Tfrc рецептора трансферрина мыши использовали в качестве внутреннего эталонного гена для определения количества входных клеток, которые использовали для определения числа копий вирусной ДНК. Вкратце, геномные ДНК мышей из тканей, инфицированных MmuPV1, разводили 1: 500 контрольной ДНК. Каждый образец приблизительно 10 нг разведенной геномной ДНК использовали в повторных реакциях ddPCR объемом 20 мкл, содержащих праймеры и зонды для MmuPV1 ( S10, таблица ) и Tfrc (Thermo Fisher Scientific, # 4458366). Генерацию капель (BioRad QX200) и ПЦР (BioRad T100) проводили в соответствии с протоколом производителя (BioRad).Протокол циклирования начинался с этапа активации фермента 95 ° C в течение 10 минут, за которым следовали 40 циклов двухэтапного цикла (94 ° C в течение 30 секунд и 60 ° C в течение 30 секунд при скорости нарастания 2 ° C / сек). . Время окончательного удлинения составляло 10 мин при 98 ° C. Для обработки данных использовался BioRad QuantaSoft 1.5.38.1118. Число клеток в образцах было оценено как половина числа копий Tfrc, поскольку каждая клетка имеет 2 копии гена Tfrc. После нормализации данных среднее число копий ДНК MmuPV1 на клетку было рассчитано для каждого образца из дублированных реакций ddPCR.

Целевое секвенирование ДНК (DNA-seq)

Один микрограмм геномной ДНК фракционировали гель-электрофорезом для удаления большей части эписомальной вирусной геномной ДНК (размер генома составляет ~ 8 т.п.н.). ДНК хозяина выделяли и разрезали на фрагменты длиной 300-500 п.н. с использованием ультразвукового прибора Covaris M220 Focused-Ultrasonicator (Covaris). Фрагментированные ДНК (~ 500 нг) подвергали репарации концов и dA-хвосту с использованием набора NEBNext Ultra Ligation (NEB, # E7445) в соответствии с инструкциями производителя.Частично двухцепочечный линкер (5′-GTAATACGACTCACTATAGCGCTGCGCTTAAGCGACT-3 ‘, 5’-PO ₄ -GTCGCTTAAGCGCAG-3′-C6) с 3′ T-выступом был лигирован с фрагментами геномной ДНК с использованием набора NEB Quick Ligation Kit (NEB Quick Ligation Kit). , M2200). Вирус-специфические праймеры (Pr2976 / Pr3277 / Pr3742) были сконструированы на основе результатов РНК-секвенирования и использовались для выборочной амплификации стыков сайтов интеграции. Были проведены два раунда по 20 циклов ПЦР для обогащения стыков интеграции в библиотеках секвенирования с использованием набора Phusion High-Fidelity PCR Kit (NEB, # E0553).Парное секвенирование с использованием метода 150 п.н. выполняли на секвенаторе HiSeq3000 в соответствии с инструкциями производителя (Illumina). Считанные данные были предварительно обработаны таким же образом, как описано в разделе «Общее секвенирование РНК», и сопоставлены с геномом химерного вируса мыши с помощью STAR v 2.5.2b со следующими параметрами: «—outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonicalUnannotated — outSAMstrandField None — outFilterType BySJout — outFilterType BySJout — outFilterType BySJout 20 alignSJoverhangMin 8 — alignSJDBoverhangMin 1 — outFilterMismatchNmax 999 — outFilterMismatchNoverLmax 0 . 3 — alignIntronMin 20 — alignIntronMax 1000000 — alignMatesGapMax 1000000 — clip3pAdapterSeq -—readFilesIn R1 . отделка . fastq . гз R2 . отделка . fastq . gz — readFilesCommand zcat — runThreadN 32 — outFileNamePrefix OutputName — outSAMtype BAM Несортированный — chimSegmentMin 20 ”. После того, как «считывания химерного соединения» и «считывания химерных пар» были идентифицированы, было выполнено дополнительное выравнивание с использованием параметров по умолчанию для фильтрации плохо сопоставленных считываний.Исходные данные и проанализированные данные целевой последовательности ДНК, подтверждающие результаты этого исследования, были депонированы в базе данных NCBI GEO (номер доступа: GSE163681).

Вычислительный анализ сайтов интеграции MmuPV1 в областях повторов ДНК и идентификация микрогомологичных последовательностей (MHS)

Чтобы спросить, есть ли сайты интеграции MmuPV1 в повторяющихся областях в геноме мышей, мы искали MmuPV1 в следующих повторяющихся элементах: LINEs, SINEs, LTR-элементах, сателлитах и ​​простых повторах, которые соответственно составляют 21.2%, 13,4%, 8,7%, 2,6% и 1,5% генома мыши (http://www.repeatmasker.org/species/mm.html) [82]. Фракции служили мерой количеств ДНК в каждом типе повторов, которые можно было сравнить с частотой интеграций MmuPV1, наблюдаемых в этих повторяющихся областях в геноме мыши. Значимость данных определялась с помощью критерия хи-квадрат. Значимость данных при множественных сравнениях корректировали с помощью поправки Бонферрони.

Микрогомологии химерных соединений вирус-хозяин определяли с помощью STAR v 2.5.2b. Ожидаемые частоты возникновения MHS на стыках были рассчитаны как 0,25 ^{(длина единицы MH)} . Значимость данных определялась с помощью критерия хи-квадрат, а значимость данных при множественных сравнениях корректировалась с помощью поправки Бонферрони.

РНКскоп

in situ гибридизация (ISH)

Определение in situ вирусных транскриптов и транскриптов хозяина было выполнено, как описано [42]. Вкратце, опухолевые ткани, индуцированные MmuPV1, фиксировали с использованием 10% формалина в PBS (pH 6.8–7.2) в течение 20 ч при комнатной температуре, обезвоживают и заливают парафином. Ткани разрезали на срезы 5 мкм с помощью микротома. Гибридизацию РНК in situ (РНК-ISH) проводили с использованием технологии RNAscope (Advanced Cell Diagnostics или ACD, Ньюарк, Калифорния) с реагентами для обнаружения RNAscope 2.5 HD — КОРИЧНЕВЫЙ (ACD, # 322310) для однократного окрашивания или реагенты для мультиплексного флуоресцентного обнаружения RNAscope V2 (ACD, # 323110) для двойного окрашивания флуоресценции в соответствии с рекомендациями производителя. Чтобы удалить сигнал от вирусной геномной ДНК, все срезы тканей были регидратированы, расщеплены сначала с помощью RNAscope Protease Plus в течение 30 мин, а затем с помощью 20 единиц ДНКазы I (Thermo Fisher Scientific, # EN0521, разбавленной в 1 × реакционном буфере с MgCl _{). 2} ) в течение 30 мин при 40 ° C.В одноплексном РНКскопическом анализе используется антисмысловой зонд для обнаружения специфической РНК; стандартные датчики называются датчиками канала 1. Зонд MmuPV1 L1 (ACD, # 473278) для канала 1 использовали для однократного (коричневого) окрашивания. Для двойного окрашивания один из зондов может находиться в канале 1, но второй зонд должен быть специально разработан ACD для использования в подходе двойного окрашивания (зонд «канал 2»). В текущем исследовании зонд MmuPV1 E6E7 (ACD, # 409771-C2) был создан для окрашивания канала 2 и был смешан в разведении 1:50 с мышиной Krt10 (ACD, # 457901) или Fabp5 (ACD, # 504331). для канала 1 до гибридизации.Сигнал детектировали с помощью набора для оценки флуоресцеина TSA (Perkin Elmer, # NEL760001KT) и сканировали с разрешением 20 × с использованием цифрового сканера патологии Aperio CS2 (Leica Biosystem). Интенсивность сигналов гибридизированной РНК в опухолевой ткани относительно нормальной ткани, окружающей опухоль, была определена количественно с использованием программного обеспечения ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

Культура клеток и нокдаун siRNA

Первичные кератиноциты мышей от новорожденных мышей C57Bl / 6NCr культивировали, как описано [83], в присутствии ингибитора киназы Rho Y-27632 (Enzo Life Sciences, # ALX-270-333).Человеческие siRNA SMARTpool, нацеленные на Pard3 (# M-040036-01-0005) и Grip1 (# M-064716-00-0005), были приобретены у Dharmacon. Неспецифическая контрольная миРНК (Dharmacon, # D-001210-01) служила в качестве неспецифической миРНК отрицательного контроля. Кератиноциты мыши, посеянные без ингибитора Rho-киназы Y-27632 [84], трансфицировали дважды каждой миРНК (40 нМ) с интервалом 24 часа с использованием набора для трансфекции LipoJet In Vitro (версия II) (SignaGen Laboratories, # SL100468). Экстракты общего белка и общей РНК получали через 24 часа после второй трансфекции siRNA.

Клеточная пролиферация и проточная цитометрия

Для анализа пролиферации клеток активность дегидрогеназы в живых клетках измеряли с использованием набора для подсчета клеток-8 (CCK-8) от Dojindo Molecular Technologies. Вкратце, первичные кератиноциты мыши инкубировали с 10% WST (водорастворимой солью тетразолия) -8 в культуральной среде в течение 1 ч при 37 ° C, и использовали оптическую плотность среды для культивирования клеток при 450 нм (измеренную в шести повторах). для расчета относительной жизнеспособности клеток.

Для анализа распределения клеточного цикла 1,5 миллиона клеток фиксировали 70% этанолом при 4 ° C в течение ночи, промывали PBS и затем инкубировали в PBS, содержащем 200 мкг / мл РНКазы A (Thermo Fisher Scientific, # P3566), 20 мкг. / мл йодида пропидия (Thermo Fisher Scientific, # EN0531) и 0,1% Triton X-100 (Promega, # H5142) при комнатной температуре в течение 30 мин. Распределение клеточного цикла определяли проточной цитометрией с использованием LSRFortessa (BD Biosciences). Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (FlowJo).

ОТ-ПЦР и ОТ-КПЦР

Суммарная РНК была экстрагирована с использованием реагента TriPure (Roche, # 11667165001), обработана ДНКазой TURBO (Thermo Fisher Scientific, # AM1907) и преобразована в кДНК с использованием обратной транскриптазы MuLV и случайных гексамеров. ПЦР-амплификацию выполняли с помощью AmpliTaq (Thermo Fisher Scientific) с использованием праймеров, перечисленных в S10 Table . RT-qPCR выполняли с использованием смеси TaqMan Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher Scientific, # 4369016) с ген-специфическими зондами Cdk1 (# Mm00772472_m1), Plk1 (# Mm00440924_m1), Fen1 (# Mm01700195_m1), Polθ Mdc1 (# Mm01273851_g1) или h3ax (Mm00515990_s1).

Вестерн-блоттинг и антитела

Для первичных кератиноцитов мыши общий белок получали из 2 миллионов клеток путем прямого лизирования клеток в 200 мкл буфера для образцов белка 2 × SDS, содержащего 5% 2-меркаптоэтанол (2-ME). Ткани мыши препарировали и гомогенизировали в буфере RIPA (500 мкл / 10 мг тканей; Boston BioProducts, # BP-115X) с добавлением коктейля ингибиторов протеазы химотрипсина, термолизина, папаина, проназы, экстракта поджелудочной железы, трипсина (Roche, # 04693159001) и ингибиторы фосфатазы (фторид натрия, ортованадат натрия, пирофосфат натрия и β-глицерофосфат) (Thermo Fisher Scientific, # 78420).Затем 24 мкл лизата смешивали с 6 мкл 4 × SDS-загрузочного буфера с добавлением 2-ME, денатурировали нагреванием при 95 ° C в течение 10 минут и наносили на 4–12% гель NuPAGE Bis-Tris (Thermo Fisher Научный). После электрофореза в буфере 1 × MOPS SDS (Thermo Fisher Scientific, # NP0001) фракционированные белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и блокировали в течение 1 ч 5% обезжиренным молоком в 1 × TBS (трис-буферный раствор), содержащем 0,05% твин. -20 (ТТБС). Первичные антитела разводили в TTBS и инкубировали с мембраной в течение ночи при 4 ° C, а затем инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.После трехкратной промывки мембраны 1 × буфером TTBS мембраны затем инкубировали с соответствующим конъюгированным с пероксидазой вторичным антителом, разведенным в 2% молоке / TTBS. После обширных промывок 1 × TTBS связанное антитело на мембране было обнаружено с помощью SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific, # 34080), визуализировано и зафиксировано системой ImageLab (Bio-Rad).

Для вестерн-блоттинга использовали следующие антитела: анти-Pard3 (Abcam, # ab191204), анти-Grip1 (Abcam, # ab226201), анти-GAPDH (Cell Signaling, # 14C10), анти-бета-тубулин (Sigma-Aldrich, # T5201), анти-CtIP (Cell Signaling, # D76F7), антифосфо-CtIP (Thermo Fisher Scientific, # PA5-37337), анти-FEN1 (Cell Signaling, # 82354) и антифосфо-h3AX (Cell. Signaling, # 9718) использовали в качестве первичных антител.В качестве вторичных антител использовали козьи антитела против кроличьего IgG (цельная молекула) — пероксидазы (Sigma-Aldrich, # A0545) и козьи антитела против мышиного IgG (Fc-специфические) — пероксидазы (Sigma-Aldrich, # A2554).

Дополнительная информация

S1 Рис. Анализ SMRT-seq сайтов интеграции MmuPV1 в опухолевых тканях мыши.

A и B, 5′-продукты RACE (A) и 3′-RACE-продукты (B) транскриптов MmuPV1 были идентифицированы с использованием различных MmuPV1-специфичных праймеров для общей РНК, выделенной из MmuPV1-индуцированных опухолевых тканей.Все продукты 5′-RACE были проанализированы с помощью SMRT-seq для идентификации транскриптов РНК химерного вируса-хозяина (A). После удаления основных продуктов вирусного полиаденилирования, полученных в результате транскрипции эписомальной ДНК MmuPV1 (красные прямоугольники), оставшиеся 3′-продукты RACE (B) анализировали с помощью SMRT-seq на предмет транскриптов химерного вируса-хозяина РНК. C и D, Распределение точек разрыва интеграции в геноме MmuPV1, идентифицированное с помощью 5′-RACE (C) — и 3′-RACE (D) -SMRT-seq. E и F, Гены-хозяева Top10 с интегрированной ДНК MmuPV1, как обнаружено с помощью 5′-RACE (E) — и 3′-RACE (F) -SMRT-seq.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009812.s001

(TIF)

S2 Рис. Распределение CJR ДНК во вкрапленных повторах в геноме мыши.

A, ДНК CJR из опухоли MmuPV1 и неопухолевых (контрольных) тканей идентифицировали с помощью целевой ДНК-seq. Число копий MmuPV1 на клетку определяли с помощью ddPCR из 10 нг геномной ДНК с использованием гена Tfrc мыши в качестве внутреннего контроля. B, Ожидаемые и наблюдаемые CJR в различных вкрапленных повторах в геноме мыши, идентифицированные с помощью целевой последовательности ДНК.Данные повторов для генома mm10 были загружены с веб-сайта repeatmasker.org (Repeat Library 20140131). Команда «IntersectBed» из пакета bedtools (https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btq033) использовалась для идентификации соединений вирус-хозяин, которые сопоставлены с известными повторяющимися областями. **, P <0,01 по критерию хи-квадрат.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009812.s002

(TIF)

S3 Рис. Возможные функции генов-хозяев в ответ на инфекцию MmuPV1, интеграцию и туморогенез.

A, Анализ проточной цитометрии кератиноцитов мыши со сниженной экспрессией Pard3 и Grip1 после обработки ген-специфической миРНК. Первичные кератиноциты мыши дважды трансфицировали 40 нМ миРНК (si-Pard3, Si-Grip1 или si-NS) с интервалом в 24 часа. Клетки фиксировали через 24 часа после второго нокдауна миРНК (KD) и анализировали проточной цитометрией в трех повторностях. PI, иодид пропидия. B, Гистограммы показывают распределение клеточного цикла после двух раундов экспрессии siRNA KD Pard3 и Grip1.Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (n = 3). * P <0,05 по парному двустороннему тесту Стьюдента t .

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1009812.s003

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим Элисон МакБрайд из NIAID за предоставление кератиноцитов мышей для этой работы. Мы благодарим Бинхуэй Шена из Национального медицинского центра «Город надежды» за его критические комментарии о факторах хозяина в MMEJ, Бактияра Карима из Национальной лаборатории исследований рака им. Фредерика за его экспертные знания в области патологии, Сяолиня Ву и Дэвида Сан из Национальной лаборатории исследования рака имени Фредерика за их ddPCR. анализ.

Список литературы

1. 1.
   Мальдарелли Ф., Ву Х, Су Л., Симонетти Ф. Р., Шао В., Хилл С. и др. Латентный период ВИЧ. Конкретные сайты интеграции ВИЧ связаны с клональной экспансией и персистенцией инфицированных клеток. Наука. 2014; 345: 179–183. pmid: 24968937
2. 2.
   Cohn LB, Silva IT, Oliveira TY, Rosales RA, Parrish EH, Learn GH et al. Пейзаж интеграции ВИЧ-1 при скрытой и активной инфекции. Клетка. 2015; 160: 420–432. pmid: 25635456
3. 3.
   цур Хаузен Х.Папилломавирусы и рак: от фундаментальных исследований до клинического применения. Нат Рев Рак. 2002; 2: 342–350. pmid: 12044010
4. 4.
   Охесина А.И., Лихтенштейн Л., Фриман С.С., Педамаллу С.С., Имаз-Россхандлер И., Пью Т.Дж. и др. Пейзаж геномных изменений при раке шейки матки. Природа. 2014; 506: 371–375. pmid: 243

5. 5.
   Исследовательская сеть Атласа генома рака. Комплексная геномная и молекулярная характеристика рака шейки матки. Природа. 2017; 543: 378–384.pmid: 28112728
6. 6.
   Келли Д.З., Флам Е.Л., Изумченко Э., Данилова Л.В., Вульф HA, Гуо Т. и др. Комплексный анализ полногеномных данных ChIP-Seq и RNA-Seq образцов первичных опухолей головы и шеи связывает сайты интеграции HPV с открытыми метками хроматина. Cancer Res. 2017; 77: 6538–6550. pmid: 28947419
7. 7.
   Парфенов М., Педамаллу С.С., Геленборг Н., Фриман С.С., Данилова Л., Бристоу К.А. и др. Характеристика взаимодействий ВПЧ и генома хозяина при первичном раке головы и шеи.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2014; 111: 15544–15549. pmid: 25313082
8. 8.
   Гао Дж., Ван Дж., Каспербауэр Дж. Л., Могилы Н. М., Тэн Ф, Гоу Х и др. Секвенирование всего генома показывает сложность как присутствующих последовательностей ВПЧ, так и интеграции ВПЧ в ВПЧ-положительные плоскоклеточные карциномы ротоглотки. BMC Рак. 2019; 19: 352. pmid: 30975103
9. 9.
   Schwarz E, Freese UK, Gissmann L, Mayer W., Roggenbuck B, Stremlau A et al. Структура и транскрипция последовательностей вируса папилломы человека в клетках карциномы шейки матки.Природа.1985; 314: 111–114. pmid: 2983228
10. 10.
    Hudelist G, Manavi M, Pischinger KI, Watkins-Riedel T, Singer CF et al. Физическое состояние и экспрессия ДНК ВПЧ в доброкачественной и диспластической ткани шейки матки: различные уровни интеграции вируса коррелируют со степенью поражения. Gynecol Oncol. 2004. 92: 873–880. pmid: 14984955
11. 11.
    Klaes R, Woerner SM, Ridder R, Wentzensen N, Duerst M, Schneider A et al. Выявление интраэпителиальной неоплазии шейки матки высокого риска и рака шейки матки путем амплификации транскриптов, полученных из интегрированных онкогенов вируса папилломы.Cancer Res. 1999. 59: 6132–6136. pmid: 10626803
12. 12.
    Акаги К., Ли Дж., Брутиан Т.Р., Падилья-Нэш Х., Сяо В., Цзян Б. и др. Полногеномный анализ интеграции ВПЧ при раке человека выявляет рецидивирующую очаговую геномную нестабильность. Genome Res. 2014; 24: 185–199. pmid: 24201445
13. 13.
    Ху З, Чжу Д., Ван В., Ли В., Цзя В., Цзэн Х и др. Полногеномное профилирование интеграции ВПЧ при раке шейки матки позволяет выявить кластерные горячие точки генома и потенциальный механизм интеграции, опосредованный микрогомологией.Нат Жене. 2015; 47: 158–163. pmid: 25581428
14. 14.
    Goodwin EC, Yang E, Lee CJ, Lee HW, DiMaio D и др. Быстрая индукция старения в клетках карциномы шейки матки человека. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000; 97: 10978–10983. pmid: 11005870
15. 15.
    Jeon S, Lambert PF. Интеграция ДНК вируса папилломы человека типа 16 в геном человека приводит к повышению стабильности мРНК E6 и E7: последствия для канцерогенеза шейки матки. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1995; 92: 1654–1658.pmid: 7878034
16. 16.
    Фрэнсис Д.А., Шмид С.И., Хоули П.М. Репрессия интегрированного промотора вируса папилломы E6 / E7 необходима для подавления роста клеток рака шейки матки. J Virol. 2000; 74: 2679–2686. pmid: 10684283
17. 17.
    Шен К., Лю И, Ши С., Чжан Р., Чжан Т., Сюй Кью и др. Дистанционное взаимодействие интегрированного фрагмента HPV с геном MYC и областью 8q24.22 усиливает аллель-специфическую экспрессию MYC в клетках HeLa. Int J Cancer. 2017; 141: 540–548.pmid: 28470669
18. 18.
    Ferber MJ, Thorland EC, Brink AA, Rapp AK, Phillips LA, McGovern R et al. Предпочтительная интеграция вируса папилломы человека типа 18 вблизи локуса c-myc в карциноме шейки матки. Онкоген. 2003. 22: 7233–7242. pmid: 14562053
19. 19.
    Warburton A, Redmond CJ, Dooley KE, Fu H, Gillison ML, Akagi K et al. Интеграция HPV захватывает и мультимеризует клеточный энхансер, чтобы генерировать вирусно-клеточный суперинхансер, который управляет высокой экспрессией вирусного онкогена.PLoS Genet. 2018; 14: e1007179. pmid: 29364907
20. 20.
    Duensing S, Lee LY, Duensing A, Basile J, Piboonniyom S, Gonzalez S et al. Онкопротеины E6 и E7 вируса папилломы человека типа 16 взаимодействуют, чтобы вызвать митотические дефекты и геномную нестабильность путем отделения дупликации центросом от цикла деления клетки. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2000; 97: 10002–10007. pmid: 10944189
21. 21.
    Duensing S, Munger K. Онкобелки E6 и E7 вируса папилломы человека типа 16 независимо друг от друга вызывают числовую и структурную нестабильность хромосом.Cancer Res. 2002; 62: 7075–7082. pmid: 12460929
22. 22.
    Спарди Н., Денсинг А., Чарльз Д., Хейнс Н., Накахара Т. и др. Онкобелок E7 вируса папилломы человека 16 типа активирует путь анемии Фанкони (FA) и вызывает ускоренную хромосомную нестабильность в клетках FA. J Virol. 2007. 81: 13265–13270. pmid: 17898070
23. 23.
    Бристоль ML, Das D, Morgan IM. Почему вирусы папилломы человека активируют реакцию на повреждение ДНК (DDR) и как клеточная и вирусная репликация сохраняется при наличии сигналов DDR.Вирусы. 2017; 9 (10): 268. pmid: 28934154
24. 24.
    Kadaja M, Isok-Paas H, Laos T, Ustav E, Ustav M. Механизм геномной нестабильности в клетках, инфицированных папилломавирусами человека высокого риска. PLoS Pathog. 2009; 5: e1000397. pmid: 193
25. 25.
    Sfeir A, Symington LS. Соединение концов, опосредованное микрогомологией: резервный механизм выживания или специальный путь? Trends Biochem Sci. 2015; 40: 701–714. pmid: 26439531
26. 26.
    Оттавиани Д., Лекейн М., Шир Д.Роль микрогомологии в структурной изменчивости генома. Тенденции Genet. 2014; 30: 85–94. pmid: 24503142
27. 27.
    Кул В., ван Шендель Р., Карамбелас А. Е., ван Хетерен Дж. Т., Окихара К. Л., Тайстерман М. Путь репарации, зависимой от тета-полимеразы, подавляет обширную геномную нестабильность в эндогенных участках ДНК G4. Nat Commun.2014; 5: 3216. pmid: 24496117
28. 28.
    Ян СС, Сяо X, Чжу X, Ансарди Д.К., Эпштейн Н.Д., Фрей М.Р. и др. Пути клеточной рекомбинации и структуры шпилечных концевых повторов вируса достаточны для интеграции аденоассоциированного вируса in vivo и in vitro.J Virol. 1997; 71: 9231–9247. pmid: 9371582
29. 29.
    Чех-Сиоли М., Гюнтер Т., Терре М., Спон М., Инденбиркен Д., Тайсс Дж и др. Анализ с высоким разрешением полиомавируса клеток Меркеля при карциноме клеток Меркеля выявляет различные паттерны интеграции и предполагает, что NHEJ и MMBIR являются основными механизмами. PLoS Pathog. 2020; 16: e1008562. pmid: 32833988
30. 30.
    Ingle A, Ghim S, Joh J, Chepkoech I, Bennett Jenson A, Sundberg JP. Новая инфекция, вызванная вирусом папилломы лабораторных мышей (MusPV).Vet Pathol. 2011; 48: 500–505. pmid: 20685915
31. 31.
    Джох Дж., Дженсон А.Б., Кинг В., Проктор М., Ингл А., Сандберг Дж. П. и др. Геномный анализ первого вируса папилломы лабораторных мышей. J Gen Virol. 2011; 92: 692–698. pmid: 21084500
32. 32.
    Cladel NM, Budgeon LR, Cooper TK, Balogh KK, Christensen ND, Myers R et al. Инфекции, вызванные вирусом папилломы мыши, распространяются на участки кожи с прогрессированием до злокачественного новообразования. J Gen Virol. 2017; 98: 2520–2529. pmid: 28942760
33. 33.Cladel NM, Jiang P, Li JJ, Peng X, Cooper TK, Majerciak V et al. Папилломавирус может передаваться через кровь и вызывать инфекции у реципиентов крови: данные двух животных моделей. Emerg Microbes Infect. 2019; 8: 1108–1121. pmid: 31340720
34. 34.
    Сперджен М.Э., Ламберт П.Ф. Передача вируса папилломы мыши (MmuPV1) половым путем в Mus musculus. eLife. 2019; 8: e50056. pmid: 31621578
35. 35.
    Cladel NM, Budgeon LR, Balogh KK, Cooper TK, Brendle SA, Christensen ND et al.Инфекция папилломавируса мышей сохраняется в тканях слизистой оболочки иммунокомпетентных мышей и прогрессирует до рака. Научный отчет 2017; 7: 16932. pmid: 29208932
36. 36.
    Сперджен М.Э., Уберой А., МакГрегор С.М., Вей Т., Уорд-Шоу Е., Ламберт П.Ф. Новая модель инфекции in vivo для изучения заболевания женского репродуктивного тракта, опосредованного вирусом папилломы. mBio. 2019; 10 (2): e00180–19. pmid: 30837335
37. 37.
    Стрикли Дж. Д., Мессершмидт Дж. Л., Авад М. Е., Ли Т., Хасегава Т., Ха Д. Т. и др.Иммунитет к комменсальным вирусам папилломы защищает от рака кожи. Природа. 2019; 575: 519–522. pmid: 31666702
38. 38.
    Groves IJ, Coleman N. Интеграция генома вируса папилломы человека в плоскоклеточный канцерогенез: чему нас научили исследования секвенирования следующего поколения? J Pathol. 2018; 245: 9–18. pmid: 29443391
39. 39.
    Люфт Ф, Клаес Р., Нис М., Дерст М., Хейльманн В., Мельшаймер П. и др. Обнаружение интегрированных последовательностей вируса папилломы с помощью лигирования-опосредованной ПЦР (DIPS-PCR) и молекулярной характеристики в клетках рака шейки матки.Int J Cancer. 2001; 92: 9–17. pmid: 11279600
40. 40.
    Кармоди MW, Джонс M, Tarraza H, Vary CP. Использование полимеразной цепной реакции для специфической амплификации интегрированной ДНК HPV-16 в силу ее связи с вкраплениями повторяющейся ДНК. Зонды Mol Cell. 1996. 10: 107–116. pmid: 8737394
41. 41.
    Rhoads A, Au KF. Секвенирование PacBio и его приложения. Геномика Протеомика Биоинформатика. 2015; 13: 278–289. pmid: 26542840
42. 42.
    Xue XY, Majerciak V, Uberoi A, Kim BH, Gotte D, Chen X et al.Полная карта транскрипции вируса папилломы мыши типа 1 (MmuPV1) в тканях бородавок мыши. PLoS Pathog. 2017; 13: e1006715. pmid: 29176795
43. 43.
    McBride AA, Warburton A. Роль интеграции в онкогенном прогрессировании рака, связанного с ВПЧ. PLoS Pathog. 2017; 13: e1006211. pmid: 28384274
44. 44.
    Чжэн З.М., Бейкер СС. Структура генома папилломавируса, экспрессия и посттранскрипционная регуляция. Передние биоски. 2006; 11: 2286–2302. pmid: 16720315
45. 45.Zhou PJ, Wang X, An N, Wei L, Zhang L, Huang X и др. Потеря Par3 способствует онкогенезу простаты за счет усиления роста клеток и изменения способов деления клеток. Онкоген. 2019; 38: 2192–2205. pmid: 30467379
46. 46.
    Bladt F, Tafuri A, Gelkop S, Langille L, Pawson T. Буллезный эпидермолиз и эмбриональная летальность у мышей, лишенных мульти-PDZ-домена белка GRIP1. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2002; 99: 6816–6821. pmid: 11983858
47. 47.
    Варадараджан Дж., Маквильямс MJ, Хьюз Ш.Лечение субоптимальными дозами ралтегравира приводит к аберрантной интеграции ВИЧ-1. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2013; 110: 14747–14752. pmid: 23959861
48. 48.
    Хьюз SH, Гроб JM. Что сайты интеграции говорят нам о сохранении ВИЧ. Клеточный микроб-хозяин. 2016; 19: 588–598. pmid: 27173927
49. 49.
    Джулиас Дж. Дж., Маквильямс М. Дж., Сарафианос С. Г., Арнольд Э, Хьюз Ш. Мутации в домене РНКазы H обратной транскриптазы ВИЧ-1 влияют на инициацию синтеза ДНК и специфичность расщепления РНКазой H in vivo.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2002; 99: 9515–9520 pmid: 12093908
50. 50.
    Гаур М., Ливитт А.Д. Мутации в мотиве интегразы D, D (35) E вируса иммунодефицита человека типа 1 не устраняют образование провируса. J Virol. 1998; 72: 4678–4685. pmid: 9573231
51. 51.
    Moody CA. Влияние репликационного стресса на патогенез вируса папилломы человека. J Virol. 2019; 93 (2): e01012–17. pmid: 30355682
52. 52.
    Spriggs CC, Laimins LA. Вирус папилломы человека и реакция на повреждение ДНК: использование путей восстановления хозяина для репликации вирусов.Вирусы. 2017; 9 (8): 232. pmid: 28820495
53. 53.
    Чыонг Л.Н., Ли Й., Ши Л.З., Хван П.Й., Хе Дж., Ван Х и др. Опосредованное микрогомологией соединение концов и гомологичная рекомбинация разделяют начальную стадию резекции концов для восстановления двухцепочечных разрывов ДНК в клетках млекопитающих. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2013; 110: 7720–7725. pmid: 23610439
54. 54.
    Ван Х., Сюй Х. Присоединение к концу, опосредованное микрогомологией: к команде присоединяются новые игроки. Cell Biosci. 2017; 7: 6. pmid: 28101326
55. 55.Сеол Дж. Х., Шим Е. Ю., Ли С. Е.. Соединение концов, опосредованное микрогомологией: хорошо, плохо и некрасиво. Mutat Res. 2018; 809: 81–87. pmid: 28754468
56. 56.
    Ван В., Уберой А., Сперджен М., Гронски Е., Маджерчак В., Лобанов А. и др. Стресс-кератин 17 усиливает заболевание, вызванное папилломавирусной инфекцией, подавляя рекрутирование Т-клеток. PLoS Pathog. 2020; 16: e1008206. pmid: 31968015
57. 57.
    Боннер В.М., Редон С.Е., Дики Дж. С., Накамура А. Дж., Седельникова О. А., Сольер С. и др. Gammah3AX и рак.Нат Рев Рак. 2008; 8: 957–967. pmid: 1

    92

58. 58.
    Turinetto V, Giachino C. Множественные аспекты гистонового варианта h3AX: маркер двухцепочечного разрыва ДНК с несколькими биологическими функциями. Nucleic Acids Res. 2015; 43: 2489–2498 pmid: 25712102
59. 59.
    Zheng L, Jia J, Finger LD, Guo Z, Zer C, Shen B. Функциональная регуляция нуклеазы FEN1 и ее связь с раком. Nucleic Acids Res. 2011; 39: 781–794. pmid: 20929870
60. 60.
    Xu H, Shi R, Han W, Cheng J, Xu X, Cheng K et al.Структурные основы распознавания 5’-лоскута и белок-белковые взаимодействия эндонуклеазы лоскута человека 1. Nucleic Acids Res.2018; 46: 11315–11325. pmid: 30295841
61. 61.
    Ньюман Дж. А., Купер CDO, Эйткенхед Х., Гилеади О. Структура хеликазного домена ДНК-полимеразы тета выявляет возможную роль в пути соединения концов, опосредованном микрогомологией. Состав. 2015; 23: 2319–2330. pmid: 26636256
62. 62.
    Кент Т., Чандрамули Г., МакДевитт С.М., Оздемир А.Ю., Померанц Р.Т.Механизм опосредованного микрогомологией соединения концов, вызванный ДНК-полимеразой человека тета. Nat Struct Mol Biol. 2015; 22: 230–237. pmid: 25643323
63. 63.
    Карвахаль-Гарсия Дж., Чо Дж. Э., Карвахаль-Гарсия П., Фенг В., Вуд Р. Д., Секельски Дж. И др. Механистические основы идентификации микрогомологии и рубцевания генома полимеразой тета. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2020; 117: 8476–8485. pmid: 32234782
64. 64.
    Блэк С.Дж., Оздемир А.Ю., Кашкина Э., Кент Т., Русанов Т., Ристич Д. и др.Молекулярная основа опосредованного микрогомологией соединения концов очищенной полноразмерной Poltheta. Nat Commun. 2019; 10: 4423. pmid: 31562312
65. 65.
    Yu X, Chen J. Контроль контрольной точки клеточного цикла, вызванный повреждением ДНК, требует CtIP, зависимого от фосфорилирования партнера связывания С-концевых доменов BRCA1. Mol Cell Biol. 2004; 24: 9478–9486. pmid: 15485915
66. 66.
    Lee-Theilen M, Matthews AJ, Kelly D, Zheng S, Chaudhuri J. CtIP способствует опосредованному микрогомологией альтернативному соединению концов во время рекомбинации с переключением классов.Nat Struct Mol Biol. 2011; 18: 75–79. pmid: 21131982
67. 67.
    Yun MH, Hiom K. CtIP-BRCA1 модулирует выбор пути репарации двухцепочечных разрывов ДНК на протяжении всего клеточного цикла. Природа. 2009; 459: 460–463. pmid: 19357644
68. 68.
    Уэртас П., Джексон С.П. Человеческий CtIP обеспечивает контроль клеточного цикла при резекции конца ДНК и репарации двухцепочечных разрывов. J Biol Chem. 2009; 284: 9558–9565. pmid: 19202191
69. 69.
    Mengwasser KE, Adeyemi RO, Ленг Y, Choi MY, Clairmont C, D’Andrea AD et al.Генетический скрининг выявляет FEN1 и APEX2 как синтетические летальные мишени BRCA2. Mol Cell. 2019; 73: 885–899. pmid: 30686591
70. 70.
    Ван Х, Цю З, Лю Б., Ву И, Рен Дж, Лю И и др. PLK1 нацелен на CtIP, чтобы способствовать соединению концов, опосредованному микрогомологией. Nucleic Acids Res. 2018; 46: 10724–10739. pmid: 30202980
71. 71.
    Wang H, Shi LZ, Wong CC, Han X, Hwang PY, Truong LN et al. Взаимодействие CtIP и Nbs1 соединяет CDK и ATM, чтобы регулировать опосредованную HR репарацию двухцепочечных разрывов.PLoS Genet. 2013; 9: e1003277. pmid: 23468639
72. 72.
    Ху Дж., Кладель Н.М., Буджен Л.Р., Балог К.К., Кристенсен Н.Д. Модель инфекции папилломавируса мыши. Вирусы. 2017; 9. v90. pmid: 28867783
73. 73.
    Сперджен М.Э., Ламберт П.Ф. Mus musculus Papillomavirus 1: новый рубеж в моделях патогенеза папилломавируса на животных. J Virol. 2020; 94 (9): e00002–20. pmid: 32051276
74. 74.
    Уберой А., Йошида С., Фрейзер И. Х., Пито Х. К., Ламберт П. Ф.. Роль ультрафиолетового излучения в заболеваниях, вызванных вирусом папилломы.PLoS Pathog. 2016; 12: e1005664. pmid: 27244228
75. 75.
    Yu L, Lobanov A, Majerciak V, Mirza S, Band V, Liu Het al. Экспрессия онкогенов ВПЧ из единого сайта интеграции в клеточных линиях рака шейки матки. 2020. bioRxiv.
76. 76.
    Сартори А.А., Лукас С., Коутс Дж., Мистрик М., Фу С., Бартек Дж. И др. CtIP человека способствует резекции концов ДНК. Природа. 2007; 450: 509–514. pmid: 17965729
77. 77.
    Махарашвили Н., Таббс А.Т., Ян Ш., Ван Х., Бартон О., Чжоу Й. и др.Каталитическая и некаталитическая роль эндонуклеазы CtIP в резекции двухцепочечных разрывов концов. Mol Cell. 2014; 54: 1022–1033. pmid: 24837676
78. 78.
    Wang H, Li Y, Truong LN, Shi LZ, Hwang PY, He J et al. CtIP поддерживает стабильность в общих хрупких сайтах и ​​инвертированных повторах за счет независимой от резекции конца эндонуклеазной активности. Mol Cell. 2014; 54: 1012–1021. pmid: 24837675
79. 79.
    Moody CA, Laimins LA. Вирусы папилломы человека активируют путь повреждения ДНК ATM для амплификации вирусного генома при дифференцировке.PLoS Pathog. 2009; 5: e1000605. pmid: 19798429
80. 80.
    Leeman JE, Li Y, Bell A, Hussain SS, Majumdar R, Rong-Mullins X et al. Вирус папилломы человека 16 способствует соединению концов, опосредованному микрогомологией. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2019; 116: 21573–21579. pmid: 31591214
81. 81.
    Добин А., Дэвис К.А., Шлезингер Ф., Дренков Дж., Залески С. и др. STAR: сверхбыстрый универсальный выравниватель RNA-seq. Биоинформатика. 2013; 29: 15–21. pmid: 23104886
82. 82.
    Bourque G, Burns KH, Gehring M, Gorbunova V, Seluanov A, Hammell M et al.Десять вещей, которые вы должны знать о сменных элементах. Genome Biol. 2018; 19: 199. pmid: 30454069
83. 83.
    Чепмен С., Макдермотт Д.Х., Шен К., Джанг М.К., МакБрайд А.А. Эффект ингибирования Rho-киназы на длительную пролиферацию кератиноцитов быстрый и условный. Stem Cell Res. 2014; 5: 60. pmid: 24774536
84. 84.
    Чепмен С., Лю X, Мейерс С., Шлегель Р., Макбрайд А.А. Кератиноциты человека эффективно иммортализуются ингибитором киназы Rho. J Clin Invest. 2010; 120: 2619–2626.pmid: 20516646

.